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研究连翘叶的主要抗菌活性成分有效部位

时间:2019-04-17
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中药学硕士论文范文第六篇:研究连翘叶的主要抗菌活性成分有效部位

中文摘要

  
  连翘(Forsythiasuspensa(Thunb)Vahl)为木犀科(Oleaceae)连翘属植物。其传统用药部位为成熟果实,具有散结消肿,清热解毒之成效。大量的研究表明连翘叶与连翘果实具有相似的化学成分和药理活性,并且连翘叶抑菌效果强于青翘和老翘。在我国中药制药和临床处方用药中,主要使用连翘的果实,连翘叶在北方除少量用于连翘叶茶的应用外,大量的连翘叶资源没有被充分利用。因此,基于连翘叶有效的抑菌活性,本论文主要以抗菌活性为指导,对连翘叶的主要抗菌活性成分有效部位进行了研究,并评价了连翘叶主要活性成分连翘酯苷A与头孢唑林、万古霉素的联合抑菌的效果。具体内容如下:
  
  1.以具有代表性的细菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、一般耐大肠杆菌、绿脓杆菌、多重耐绿脓杆菌、肺炎链球菌等为研究对象,以抑菌圈直径为抑菌效果评价指标,筛选了对连翘叶40%乙醇为提取物敏感的细菌。结果表明,连翘叶的40%乙醇提取物对一般耐大肠杆菌、肺炎链球菌无抑菌活性,对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用。
  
  2.以D101大孔树脂为柱分离材料,利用中低压制备分离技术,对连翘叶40%乙醇提取物进行了初步分离,以抑菌活性为指标,评价了E1、E2、E3、E4、E55个组分的抑菌效果。结果表明E3组分为抑菌活性较强的部位。进一步以C18为柱分离材料,对组分E3进行了分离,并对分离组分进行了抑菌活性评价。结果表明分离组分M1为E3组分的抑菌活性部位。
  
  3.利用制备液相分离技术对组分M1进行成分或组分的敲除,得到了组分或成分F1、F2、F3、F4、F5,并进行抑菌活性评价。结果表明F2和F4为抑菌活性较强的组分;经液相分析、标准品对比,F4为连翘酯苷A;组分F2经SephadexLH-20柱层析分离、NMR分析,以及标准品验证,证明为ForsythensideF和ForsythiasideI;抑菌活性结果表明ForsythensideI具有抑菌活性。结论,连翘叶中的主要抑菌活性成分为连翘酯苷A、连翘酯苷I.
  
  4.采用微量棋盘稀释法评价了连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用的抑菌活性。结果表明,连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用时对金黄色葡萄球菌表现为相加作用;连翘酯苷A与万古霉素联用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑制作用表现为协同作用;连翘酯苷A与头孢唑林联用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑制作用表现相加作用。结论:连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素联用时,具有一定的减量增效作用。
  
  5.利用HPLC法建立了连翘叶活性部位E3的活性成分连翘酯苷A、连翘酯苷I的含量测定方法和特征图谱。结果表明,E3中活性成分连翘酯苷A的含量范围为0.53-0.58mg/mg,连翘酯苷I的含量范围为0.06-0.07mg/mg;E3的液相特征图谱中具有4个特征峰,以3号峰为对照峰,1号峰的相对保留时间范围为0.6667-0.7227,相对峰面积范围0.1544-0.1987;2号峰的相对保留时间范围为0.7341-0.7477,相对峰面积范围为0.0264-0.07937;4号峰相对保留时间范围为1.5485-1.6035,相对峰面积范围为0.0623-0.1058,其中3个特征峰分别为连翘酯苷I、连翘酯苷A、芦丁。
  
  6.前面实验中,初步确定连翘酯苷A,连翘酯苷I为连翘叶主要的抑菌活性成分,后期研究了连翘叶的谱效关系,明确了连翘叶的抗氧化与抗菌作用之间的共性指标成分连翘酯苷A.
  
  关键词:连翘叶;提取分离;抗菌作用;指纹图谱;含量测定;谱效关系

连翘叶

ABSTRACT

  
  Forsythia suspensa (Thunb) Vahl belongs to forshthias in OIesceae. The ripe fruit is a kind of traditional Chinese medivine which is non-toxic, bitter in taste and slight cold-natured. Modern studies show that the chemical composition of forsythia suspense leave is similar to the fruit of forsythia suspensa, and the pharmacological activity is similar. And its bacteriostatic effect is even stronger than that of Yu Qingqiao and Lao Qiao. However, forsythia suspense leaves are not taken seriously in China, At the same time, forsythia suspensa fruit is mainly used in pharmaceutical and clinical prescription, while forsythia suspense leaves were abandoned, not being used. Therefore, in order to make full use of forsythia suspense leaves resources. This article is mainly guided by antibacterial activity, the antibacterial components of forsythia suspensleaves were screened. And evaluate the antibacterial effect of a combination of the main active ingredients of Forsythia suspensa leavesof forsythoside A and cefazolin and vancomycin effect.Specific contents are as follows:
  
  1. This study selected the representative upper respiratory tract bacteria: Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, multiple Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, using the diameter of bacteriostasis as an evaluation index. The results showed that the 40% ethanol extract of forsythia suspense leaves had no bacteriostatic activity to common Escherichia coli and Streptococcus pneumoniae, and had certain antibacterial activityagainst other bacteria. Therefore, this subject takes the 40% ethanol extract of forsythia suspense leaves as the research object, and carries out an experimental study on it.
  
  2. The 40% ethanol extract of forsythia suspense leaves was separated by medium and low pressure preparation, and theD101 macroporous resin was used as the separation material, E1, E2, E3, E4 and E5 are obtained. The strength of bacteriostatic activity was evaluated by the diameter of bacteriostasis circle, and E3 was selected as the part of strong bacteriostasis. Therefore, the component E3 is the subject of the next experiment. Then, the separation technology of medium and low
  
  pressure was used to separate the component E3, and C18 was used as column separation material, and M1, M2 and M3 were obtained. In the same way, the strength of bacteriostatic activity was evaluated by the diameter of bacteriostasis circle, and M1 was selected as the part of strong bacteriostasis.
  
  3. The component of M1 were knocked out by the preparation of liquid phase separation technology, the components F1, F2, F3, F4 and F5 were obtained. The bacteriostatic activity was also evaluated by the diameter of the bacteriostasis, and F2 and F4 were the main antibacterial components.Component F4 is determined to be the forsythoside A according to the comparison with the standard product. There are two compoents in the F2, so F2 continues to be separated. F2 was separated by hydroxypropyl dextran gel column (Sephadex LH-20) and forsythenside F and forsythoside I were identified. Evaluation of bacteriostasis activity by Oxford cup method, and it wasfound that forsythenside F had no bacteriostasis activity. It was concluded that the Bacteriostasis of forsythia suspense leaves is forsythoside A and forsythoside I.
  
  4. Thetrace chessboard dilution method was used to assess the antibacterial activity of the combination of forsythoside A and cefazolin and vancomycin.According to the results,when forsythosideA was combined with cefazolin and vancomycin, an additive effect was shown, and the combination of forsythosideA with vancomycin produced a significant synergistic inhibitory effect and reduced significantly the amount of vancomycin. Conclusion: forsythoside A and cefazolin and vancomycin combination,has a certain synergistic effect of reduction.
  
  5. The content determination method and characteristic fingerprint of active component of forsythoside A and forsythoside I were established by HPLC method.The results showed that the content range of the active component of forsythoside A in E3 was 0.53-0.58mg/mg, and the content range of Forsythoside I was 0.06-0.07mg/mg; there are 4 characteristic peaks in the liquid phase characteristic map of E3.With the No. 3 peak as the control peak, the relative retention time of peak 1 is 0.6667-0.7227, and the relative peak area range is 0.1544-0.1987; the relative retention time of peak 2 is 0.7341-0.7477, and the relative peak area is 0.0264-0.07937; The relative retention time range of peak 4 is 1.5485-1.6035, and the relative peak area is 0.0623-0.1058. 3 of the characteristic peaks were Forsythoside I, Forsythoside Aand rutin.
  
  6. In the first part of the experiments, Forsythoside A, Forsythoside I were identified as the main antibacterial components of Forsythia suspense leaves. The later period,the spectral effect of Forsythia suspenseleaves was studied, and the common index of the antioxidant and antibacterial activity ofForsythia suspense leaves was defined as Forsythoside A.
  
  Key words: Forsythia suspense leaves; Extraction and Separations; Antiseptic effect; fingerprint; Determination of content;spectrum-effect correlation patter
 

目录

  第一章绪论
  
  1.1天然抗菌药物的研究进展

  
  二十世纪初抗生素的发现,无疑是人类医疗技术史上的重大事件之一,它的出现使许多原来难以治疗的不受控制的疾病得到了很好的治疗。但随着抗生素的更新换代以及大量的广泛使用,细菌对抗生素的耐药性日益增强,达到了无法控制的地步,很多疾病无法得到治疗,形势已发展成为严重的卫生问题。如耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA),人类面在治疗它时,往往会束手无策,因为它达到了人类不能控制的地步。对头孢类和与甲氧西林相同结构的?内酰胺类抗生素均产生不同程度的耐药性。以前认为,万古霉素是抗击MRSA的最后一道防线,但耐万古霉素的MRSA菌株已经出现[1-2].最新的抗MRSA唑啉酮类药物以及链阳菌素类药物在几年前年刚刚投放入市场,但现在已经出现了Linezoid耐药型MRSA[3-4]人类对抗生素的使用,已经严重到滥用,从而导致细菌耐药菌株上升。但是,新抗生素产生的步伐明显跟不上耐药菌株上升的趋势。此外,研发一个新的抗生素所发费的时间需要长达几十年,或更长久。人力,财力的发费也是相当多大的。由于中药成分较复杂,毒副作用小,细菌较少对中药产生耐药性[5].所以几千年来,中国的清热解毒的药用植物在治疗感染性疾病方面发挥着重要作用。研讨和开发利用抗菌中草药对治疗耐药菌株引起的疾病和抗生素不足问题具有划时代的意义。
  
  因此,从天然产物中开发抗菌活性成分,已经受到国内外很多学者的关注[6].文献[7-8]研究显示,Amin发现了黄连小孽碱对许多病原真菌和细菌有明显的抗菌作用。李建志等[9]报道了11种中草药具有抗菌作用。刘亚静等[10]阐述了中药肉桂的抗菌药理作用。姚帆等[11]发现中药野菊花具有抗菌抗病毒的作用。彭金菊[12]等人阐述了很多中药及其它们的复方对温和气单胞菌的抗菌作用。雷智东[13]研究了陈香抗菌活性成分的研究。江震献[14]同样也研究了蝎子草抑菌活性成分的研究。所以说,越来越多的人参与到从天然产物中寻找抗菌活性成分的研究。从天然产物中寻找抗菌活性成分,已经成为研究热点之一,同时,从天然产物中寻找抗菌活性成分亦是发掘新一代抗菌先导物的重要途径之一[15].但,目前相关研究大多数处于初级阶段,要实现抗菌活性成分在临床中可以使用,还需要很多实验的研究
  
  1.2连翘叶的研究现状
  
  连翘(Forsythiasuspense)是木犀科连翘属连翘的干燥果实[16],是我国临床常用传统中药。连翘作为一味传统中药,药用历史已达两千年。在历代本草典籍中,连翘的药用部位是果实,有关叶子入药的记载不是很多,如中华本草及中药大词典中关于连翘茎叶的记载:味苦,性寒,药效为清热解毒[17],主治心肺积热。此外在玉樵医令中关于连翘叶的相关记载为:味苦、微辛、性寒、可泻火,寒能清热,入心肺二经。
  
  这些古典典籍说明,连翘叶在入药过程中可以抑制病原菌,说明其本身应该具有抑菌作用,并且现代的一些文献研究表明连翘叶提取物对多种细菌具有很强的抑制作用,如马文兵[18]等通过纸片扩散法研究了连翘叶醇提物的抑菌活性,发现了连翘叶醇提物对金黄色葡萄球菌、白色念球菌和大肠杆菌有很好的敏感作用。杨天鸣[19]等报道了连翘水提物抗菌作用的实验研究,简永耀[20]等报道了连翘的化学成分及药理学研究。王欢[21]等研究了连翘提取物对临床致病菌体外抗菌作用。刘玉婕[22]等研究了配伍后的金银花、连翘对临床中的11种致病菌的作用。这些文献中主要报道了连翘叶提取物的抑菌活性,而未见对连翘叶中具体的抑菌活性成分进行研究报道。所以,研究连翘叶的抑菌活性成分为本课题的主要内容。下面将近年来连翘叶的化学成分,药理作用研究进展状况进行综述,以便为后续连翘叶的抑菌活性成分的研究奠定工作基础。
  
  1.2.1连翘叶的化学成分
  
  近年来,关于连翘叶的化学成分的研究已有大量的文献报道,如EndoKatsuya等人从连翘叶中分离出连翘酯苷A[23]之后,其他化学研究者随后也从连翘叶中分离出连翘酯苷B[24],C[25],D[26],E,F,G,H,I[27],J[28].R-forsythosideJ,Suspensaside,LiaqiaoxiideA[29]等化合物。除此之外,还发现了一些微量元素[30-31].研究显示[32],就化学成分来说,连翘叶与果实种类基本一致,但含量具有明显差异。如李发荣等[33]利用高效液相色谱分析法比较连翘叶及靑翘和老翘中连翘苷的含量,结果显示,连翘叶中连翘苷的含量比靑翘中的连翘苷高了很多倍。王金梅等[34]人研究了连翘叶、茎及果实中芦丁的含量,发现七月份连翘叶中芦丁的含量远高于果实中芦丁的含量。
  
  1.2.2连翘叶的药理作用研究
  
  近年来的文献研究表明,连翘叶的药理作用主要有抑菌、抗氧化、抗病毒,解热镇痛,抗内毒素、减肥、镇吐、利尿、保护心脏及骨骼肌[35]、抗疲劳[36]、降血脂[37]、保肝[38]等作用。
  
  1.2.2.1抗菌活性大量的文献
  

  研究显示,连翘叶对多种细菌具有较强的抑制作用,且抗菌谱广。如马文兵等[39]通过纸片扩散法研究了连翘叶醇提物的抑菌活性,研究发现了连翘叶醇提物对金黄色葡萄球菌、白色念球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为18mm、7.8mm、8.5mm.段飞等[40]人通过用药敏纸片法比较了连翘叶、靑翘、老翘提取物的抑菌活性,结果表明,连翘叶的抑菌活性能力强于靑翘和老翘,且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用与浓度呈剂量依赖关系。其他相关文献发现连翘叶提取物、青翘、老翘的抑菌作用进行了研究,结果显示都有一定抑菌作用,抗菌活性的强弱顺序为连翘叶>青翘>老翘。WongRWk[41]等人报道了连翘叶对口腔中的细菌有抗菌活性[42-43].综上所述,连翘叶在抗菌活性方面有很好的发展前景,寻找连翘叶中的抗菌活性成分已引起了一些学者的注意。有文献报道发现连翘叶中的成分连翘苷有抑菌活性,但是其抑菌活性不强[44].
  
  1.2.2.2抗氧化作用研究
  
  发现人体内的抗氧化活性主要是靠两种方法来完成的,一是消除活性氧,二是活性氧非活性化来完成的。朱淑云等人[45]报道了关于连翘及叶提取物对小鼠细胞的氧化挫伤有保护作用[46-47],同时还发现了连翘叶提取物可以降低MDA,SOD,POD值以及抑制血清中ALT,AST,AKP的异常增高[48].王燕[49]测定了连翘果实、花和叶的甲醇提取物的总酚、总黄酮含量,并通过其对DPPH?和ABTS+?的清除能力的测定,比较其抗氧化活性。结果表明,3月份连翘叶的抗氧化活性比花、果实的抗氧化活性高。贾东升等[50]研究连翘叶提取物对自由基(包括DPPH?、OH?等)的清除作用,以及对Fe3+的还原能力,实验结果表明,连翘叶提取物的抗氧化活性相当强。
  
  1.3连翘叶活性部位E3的生物活性成分含量测定和特征图谱的研究

  
  近年来,学者们建立了各种化学方法,用来监测、评价连翘叶的质量标准如外观特征,显微结构,酸溶性浸出物的含量[51],成分含量的测定,显色反应和薄层色谱法鉴别[52]等作为鉴别的主要方法。虽然可以控制连翘叶的质量,但无法对连翘叶进行深层次的控制。中药有效成分的含量测定是实现药品质量可控的关键因素,是评价药品质量的重要手段,是中药质量标准的主要检测项目之一。文献报道,连翘叶中的主要化学成分含量高的为连翘苷和连翘酯苷A,因此,常将连翘苷和连翘酯苷A作为连翘中的指标成分。其在2015版药典中作为指标性成分用于连翘药材的质量控制。实验表明,连翘叶与连翘果实在主要化学成分上很类似,因此,有研究常将连翘苷和连翘酯苷A作为连翘叶的指标性成分进行评价。众所周知,中药具有多成分,多靶点,多途径的重要特征,近年来,以药效成分群进行中药物质基础的4研究逐步收到重视,但是关于连翘叶的此方面研究还是较少,更全面客观的连翘叶质量评价体系亟待建立。中药特征图谱以指纹图谱中的特征峰进行质量控制,在指纹图谱的评价基础上更具有针对性,是当前用于中药质量鉴别的重要手段之一。同样,关于连翘叶提取物的特征图谱很少有文献报道。所以本文以抗菌有效活性成分的含量和特征图谱[53-54]来作为连翘叶活性部位样品的关键性评价指标。旨在为建立相对客观完善的质量评价体系。
  
  1.4研究内容及目的
  
  课题开展前,查阅了关于连翘叶的抑菌活性的相关文献,发现连翘叶的抑菌活性的研究仅限于粗提物层面,有效抑菌成分的文献很少报道。为此,本文通过建立体外的抑菌活性测试体系,确定了连翘叶的抗菌主要活性部位,同时对活性部位中的抗菌活性成分进行了全面的研究,同时采用微量棋盘稀释法评价了连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用的抑菌活性。然后很据连翘叶活性部位中的抑菌活性成分含量的高低和特征图谱对连翘叶活性部位的质量进行控制。采用40%乙醇对连翘叶进行提取,利用抑菌活性筛选的方法,缩小目标范围。通过D101大孔树脂、C18柱材料分离手段筛选出具有较强的抗菌部位E1,然后利用制备柱(C18),Sephadex-LH-20柱色谱等色谱分离手段对具有活性部位E1的化学成分分离,最后采用LC-MS,NMR结合文献确定化合物的结构式。对分离的单体化合物进行抑菌活性实验目的是确定具有抑菌活性的化学成分。然后采用微量棋盘稀释法评价了连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用的抑菌活性。最后以不同批次的连翘叶活性部位中的抑菌有效成分的含量和特征图谱,评价连翘叶活性部位的质量。同时,研究了连翘叶的谱效关系,明确了连翘叶的抗氧化与抗菌作用之间的共性指标成分连翘酯苷A.
  
  1.5研究方案
  
  1.连翘叶粗提物样品的制备。
  
  2.粗提物进行初步分离,以牛津杯法进行抑菌活性筛选,确定活性较强部位。
  
  3.对最优活性部位进一步分离和分析,鉴定活性成分群的主要化学成分,并进行抑菌活性测试,确定主要活性成分。
  
  4.从中药整体出发,采用敲除/敲入策略进一步验证连翘叶的抑菌活性成分,明确其药效物质基础。
  
  5.采用棋盘稀释法进行连翘酯苷A与西药抗生素联用的抑菌作用分析,初步探讨中西合用的可行性。
  
  6.以不同批次的连翘叶活性部位中的抑菌有效成分的含量和特征图谱,评价连翘叶活性部位的质量。
  
  7.测了18个不同产地连翘叶提取物的指纹图谱,及其抗氧化活性。目的是评价连翘叶抗氧化的谱效关系。
  
  1.6研究意义
  
  通过对连翘叶的抗菌活性成分的全面研究,找到了起抗菌活性的单体化合物,为天然抗菌药物的研发提供理论依据。在此基础上建立了以连翘叶提取物中的抗菌活性成分含量和特征图谱来评价连翘叶活性部位的质量。后期研究了连翘叶的谱效关系,明确了连翘叶的抗氧化与抗菌作用之间的共性指标成分连翘酯苷A.此外,本实验也为研究抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌方面提供了理论依据和和指导。

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  第二章连翘叶抑菌活性部位筛选
  2.1实验仪器与材料
  2.1.1供试药材及菌种
  2.1.2实验仪器与试剂
  2.2实验方法
  2.2.1连翘叶提取及有效部位的分离
  2.2.2牛津杯法抑菌活性测定
  2.3结果与分析
  2.3.1抑菌活性部位筛选
  2.4讨论

  第三章采用敲除/敲入策略辨识连翘叶抑菌成分
  3.1实验仪器与试剂
  3.2供试菌种
  3.3实验方法
  3.3.1敲除成分制备
  3.4牛津杯法抑菌活性
  3.5样品溶液配制
  3.6结果与分析
  3.6.1敲除成分抑菌活性评价结果
  3.7敲除/敲入有效组分前后抑菌活性评价
  3.7.1敲除有效组分前后抑菌活性评价
  3.7.2敲入组分F2、F4抑菌活性评价
  3.8讨论
  3.8.1抑菌活性成分
  3.8.2单体化合物的鉴定

  第四章微量棋盘法评价连翘酯苷A与西药联合抑菌活性测定
  4.1实验材料及仪器
  4.2供试菌种
  4.3实验方法
  4.3.1最小抑菌浓度的测定
  4.3.2微量棋盘稀释法测连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素联合MIC值
  4.3.3部分抑菌浓度(FIC)指数的计算
  4.4实验结果与分析
  4.4.1微量棋盘稀释法测连翘酯苷A与西药联合抑菌结果
  4.5讨论

  第五章连翘叶抑菌有效部位(E3)的活性成分的含量测定
  5.1仪器与材料
  5.2实验方法
  5.2.1样品的制备
  5.2.2液相条件的摸索
  5.3方法学验证
  5.3.1对照品溶液的制备
  5.3.2供试品溶液的制备
  5.3.3线性关系的考察

  5.4实验结果与分析
  5.4.1精密度试验
  5.4.2稳定性试验
  5.4.3重复性试验
  5.4.4加样回收率试验
  5.4.5样品含量测定
  5.5讨论

  第六章连翘叶抑菌活性部位(E3)高效液相色谱特征图谱研究
  6.1仪器与材料
  6.2样品的制备
  6.3方法与结果6.3.1液相条件
  6.3.2对照品溶液的制备
  6.3.3供试品溶液的制备

  6.3.4精密度试验7
  6.3.5重复性试验
  6.3.6稳定性试验
  6.3.7特征图谱的建立
  6.4特征图谱相似度评价
  6.5讨论

  第七章连翘叶抗氧化谱效相关质量评价研究
  7.1仪器与材料
  7.2实验材料
  7.3实验方法
  7.3.1连翘叶提取物的制备
  7.3.2不同产地连翘叶指纹图谱测定
  7.4不同产地连翘叶抗氧化活性成分及总酚含量的测定
  7.4.1不同产地连翘叶提取物的抗氧化活性的测定
  7.4.2不同产地连翘叶提取物中的总酚含量测定
  7.5数据分析

  7.6实验结果与分析
  7.6.1不同产地连翘叶指纹图谱
  7.6.2不同产地连翘叶抗氧化活性成分及总酚含量
  7.6.3总酚含量与抗氧化之间的双变量相关分析
  7.6.4谱效关系分析
  7.7结论

第八章总结与展望
 

  8.1总结
  
  本文主要以连翘叶抗菌活性为指导,对连翘叶的抗菌活性部位进行了筛选,并对活性部位中的化学成分进行了充分的研究。总结如下:
  
  1.依据本课题组之前的相关实验结果,本文选用40%乙醇为提取溶剂。除此之外,本文选了具有代表性的细菌:金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,一般耐大肠杆菌,绿脓杆菌,多重耐绿脓杆菌,肺炎链球菌,以抑菌圈直径为评价指标。结果表明,连翘叶的40%乙醇提取物对一般耐大肠杆菌、肺炎链球菌无抑菌活性,对其他细菌都有一定的抑菌活性。因此,本课题以连翘叶40%乙醇提取物为研究对象,对其进行下一步的实验研究。
  
  2.采用中低压制备分离技术,以D101大孔树脂为柱为分离材料,对连翘叶40%乙醇提取物进行了初步的分离,得到了E1、E2、E3、E4、E55个组分。以抑菌圈直径大小评价抑菌活性的强弱,筛选得到E3为抑菌活性强的部位。因此将组分E3作为下一步的实验的研究对象。
  
  3.采用中低压制备分离技术,继续对组分E3进行分离,以C18为柱分离材料,得到了M1、M2、M33个组分。同样,采用抑菌圈直径大小评价抑菌活性的强弱,筛选得到M1为抑菌活性较强的部位。因此,将组分M1作为下一步实验的研究对象。
  
  4.为了全面地研究连翘叶中的抗菌活性成分,继续对组分M1进行研究。利用制备液相分离技术对组分M1进行成分或组分的敲除,得到了组分或成分F1、F2、F3、F4、F5.同样采用抑菌圈直径大小评价抑菌活性的强弱,得到组分或成分F2、F4为抑菌活性较强的组分或成分,且成分F4根据与标准品的比对,确定为连翘酯苷A.组分F2中有两个单体成分,所以继续对F2进行分离,利用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱(SephadexLH-20)对F2进行分离、鉴定,得到了两个单体化合物ForsythensideF和ForsythiasideI.结合牛津杯法评价抑菌活性的强弱,发现ForsythensideF没有抑菌活性。后又采用敲除和敲入目标成分方法,同样得出ForsythiasideA,ForsythiasideI为抗菌活性强的成分。结论,连翘叶中的抑菌活性成分为连翘酯苷A、连翘酯苷I.
  
  5.抗生素的广泛滥用,导致了临床上耐药菌株不断的增加,严重地威胁着人类的健康,所以减少抗生素的使用量对临床上用药有着深远的意义。中西药联合使用的优势在于利用中西药物之间的相互作用,可以提高中药或者西药的疗效,减少西药的使用剂量,减少毒副作用,在一定程度上可以降低抗生素的耐药性。本实验中发现连翘酯苷A为连翘叶抑菌活性较强的活性成分。因此,采用微量棋盘稀释法评价连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用时的抑菌活性。结果表明,连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用时对金黄色葡萄球菌表现为相加作用,连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用时对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现相加、协同作用。说明连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素联用时,具有一定的减量增效作用所以,本实验的结果在抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌方面有很好的发展前景。
  
  6.由前面的实验知E3为连翘叶抑菌活性强的部位,此部分实验将研究E3的质量标准。从以下两个方面研究,分别为活性成分的含量测定、特征图谱研究。
  
  结果表明,活性成分连翘酯苷A、连翘酯苷I的含量加起来达到60%以上,满足了标准的要求。同时,建立了连翘叶提取物的液相特征图谱,确定了4个共有特征峰,并指认了其中3个特征峰的结构,分别为连翘酯苷I、连翘酯苷A、芦丁。说明了此方法准确、简便、可靠、重复性好,可以更好的控制连翘叶药材的内在质量,且提供了科学根据。7.前面实验中,初步确定连翘酯苷A,连翘酯苷I为连翘叶主要的抑菌活性成分,后期研究了连翘叶的谱效关系,明确了连翘叶的抗氧化与抗菌作用之间的共性指标成分连翘酯苷A.
  
  8.2创新点
  
  1.本课题通过对连翘叶40%乙醇提取物进行抑菌活性的测定,筛选出了抑菌活性最好的成分连翘酯苷A、连翘酯苷I.
  
  2.采用微量棋盘稀释法对评价连翘酯苷A和头孢唑林、万古霉素分别联用时的抑菌活性,发现连翘酯苷A具有减量增效的作用。
  
  8.3展望
  
  本课题从连翘叶中筛选出了抑菌活性最好的成分连翘酯苷A和连翘酯苷I.尤其是在体外发现连翘酯苷A和连翘酯苷I对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,并且,连翘酯苷A与头孢唑林、万古霉素在体外联用对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有减量增效作用。但是该实验仅仅只做了体外研究,在体内连翘酯苷A与西药联用是否具有减量增效作用,还需要进一步的研究。此外,连翘叶的E2洗脱段的抑菌活性与粗提物的抑菌活性相差不太多,说明E2段中也存在抑菌活性成分,也需进行进一步的研究。

  参考文献

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