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探讨天名精内酯酮对小麦全蚀病菌中的作用

时间:2019-04-15
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药学硕士论文范文第五篇:探讨天名精内酯酮对小麦全蚀病菌中的作用
  
摘 要
  
  小麦全蚀病是由小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var. tritici Walker)引起的一种分布较广、为害性较强的世界性病害,该病为一种土传病害,一旦发生较难根除。
  
  天名精内酯酮是一种倍半萜内酯类化合物,广泛分布于菊科天名精属植物中,对小麦全蚀病菌具有显着抑制作用,具有进一步开发利用的价值,但该化合物对小麦全蚀病菌的抑菌机制尚不清楚。课题组前期经荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫金法亚细胞定位等研究中发现天名精内酯酮在小麦全蚀病菌中作用的细胞器为线粒体,且对生物氧化有一定影响。本研究以小麦全蚀病菌为供试菌株,从组织病理学观测、生化与分子生物学水平研究以及同源模建与分子对接等手段对天名精内酯酮作用靶标进行初步鉴定。取得如下主要结果:
  
  1、测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的抑菌活性以及与线粒体呼吸链旁路呼吸酶抑制剂水杨肟酸(SHAM)的增效作用。结果表明:天名精内酯酮对小麦全蚀病菌有显着的抑制作用,EC50 为 40.30 ?g/mL.天名精内酯酮与 SHAM 的共毒系数为 146.1 显着大于 120,表明天名精内酯酮与 SHAM 有显着增效作用。因此,推测天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显着抑制作用。
  
  2、测定天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链复合酶 I、II、III、IV、V、I+III、II+III以及柠檬酸合酶(CS)的浓度和时间效应,并通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析了相关酶基因 mRNA 的相对表达量。结果表明:天名精内酯酮处理供试菌株后,呼吸链复合酶活性受到不同程度的抑制,尤其是复合酶 III、I+III 和 II+III.
  
  EC30、EC50 和 EC70 浓度处理下,天名精内酯酮可致供试菌株呼吸链复合酶 III 的活性分别降低了约 30%、60%、87%,复合酶 I+III 的活性分别降低了 26%、45%和 76%,复合酶 II+III 的活性分别降低了 50%、60%、85%.供试菌株呼吸链复合酶 III、I+III 和 II+III的活性与天名精内酯酮处理浓度和时间呈负相关;且线粒体呼吸链复合酶 III 基因 GgCyc对天名精内酯酮较为敏感。由此推测呼吸链复合酶 III 是天名精内酯酮潜在靶蛋白之一。
  
  3、建立小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系,并将潮霉素磷酸转移酶基因(hph)转入供试菌株基因组 DNA 中。结果表明:小麦全蚀病菌产生原生质体较佳条件为:1 mL1.4%裂解酶中,0.035 g 菌丝在 31℃、90 rpm 酶解 2.2 h,产生的原生质体为 9.83 × 107原生质体/mL,原生质体活力达到 96.27%.在此条件下转化 hph,转化率为 46-54 个转化子/?g DNA.小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系的建立为构建小麦全蚀病菌突变菌库奠定基础。
  
  4、构建成功供试菌株呼吸链复合酶 III 基因 GgCytc1、GgCytb 和 GgIsp 的 RNAi 以及过表达突变菌株,并进一步测定了突变菌株菌丝生长速率、菌落形态以及对 H2O2 和天名精内酯酮的敏感性。结果表明:沉默突变菌株?GgCytc1、?GgCytb 和?GgIsp 的菌丝变细,端部分枝减少,菌丝生长速率较慢,对 H2O2 产生的氧化压敏感性有一定程度降低。沉默突变菌株?GgIsp 对天名精内酯酮的敏感性显着降低,EC50 为 156.18 ?g/mL,而过表达突变菌株 OEIsp 对天名精内酯酮较为敏感 EC50 为 25.88 ?g/mL.由此推测,复合酶 III 铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮潜在靶标之一。
  
  5、测定野生型菌株及突变菌株的黑色素含量、过氧化物酶、漆酶、菌株致病性、离体和活体条件下呼吸链复合酶 III 活性以及线粒体氧消耗速率。结果表明:(1)与野生型和过表达菌株相比,天名精内酯酮(100 ?g/mL)处理后,沉默菌株?GgCytc1、?GgCytb、?GgIsp 以及天名精内酯酮抗性菌株 24-HN-1(实验室保存)的黑色素含量显着增加(约 50-100%)。(2)天名精内酯酮 EC80 处理后,野生型菌株及突变菌株的过氧化物酶活性显着增加,而?GgIsp 的过氧化物酶活性与对照相比无显着差异。?GgCytc1、?GgCytb、?GgIsp 和 24-HN-1 的漆酶活性显着降低(约 47,37,41 和 44%),其致病力较弱与漆酶活性一致。(3)在离体条件下,用天名精内酯酮(0、EC20、EC80)处理后,除了?GgIsp 和 24-HN-1 呼吸链复合酶 III 活性并无显着变化,其余菌株呼吸链复合酶 III活性均显着降低;在活体条件下,天名精内酯酮 EC20 处理后,呼吸链复合酶 III 活性均有一定程度增加,EC80 处理后,复合酶 III 活性显着受到抑制,但是?GgIsp 和 24-HN-1呼吸链复合酶 III 活性变化并不显着。(4)抗霉素 A(20 ?g/mL)处理菌株后,小麦全蚀病菌野生型菌株、?GgCytc1、?GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb 和 OEIsp 的线粒体氧消耗速率显着受到抑制(约 95、89、92、58、92、92 和 88%),而沉默突变菌株?GgCytb的线粒体氧消耗速率无明显变化;天名精内酯酮(EC80)处理菌株后,小麦全蚀病菌野生型菌株、?GgCytc1、?GgCytb、24-HN-1、OECytc1、OECytb 和 OEIsp 的线粒体氧消耗速率显着受到抑制(约 81、77、78、58、72、73 和 70%),而沉默突变菌株?GgIsp的线粒体氧消耗速率无显着变化。由上述结果推测铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮的潜在靶标之一。
  
  6、以酵母(Saccharomyces cerevisiae)呼吸链复合酶 III 细胞色素 c1(Cytc1),细胞色素 b(Cytb)和铁硫蛋白(ISP)亚基的三维结构为模板,通过 SWISS-MODEL 软件对供试菌株 Cytc1、Cytb 和 ISP 亚基进行了同源模建以及活性腔预测,并将天名精内酯酮分别与 Cytc1、Cytb 和 ISP 亚基的活性腔进行分子对接。结果表明:Cytc1、Cytb和 ISP 亚基活性腔中的八个氨基酸残基(Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166 和 Tyr230)可能为天名精内酯酮的结合位点。
  
  综上所述,天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显着抑制作用,且呼吸链复合酶 III 是其潜在的靶蛋白之一。结合课题组前期研究结果推测天名精内酯酮作用机制为:
  
  天名精内酯酮在供试菌株线粒体中富集,影响呼吸链复合酶活性,尤其是复合酶 III,阻断呼吸链电子传递,致能量形成受阻,线粒体中积累大量 ROS,引起供试菌株一系列的氧化胁迫,最终线粒体释放凋亡因子,引起细胞凋亡而达到抑菌目的。
  
  关键词:天名精内酯酮;小麦全蚀病菌;线粒体呼吸链;细胞色素 bc1复合体;RNAi
药学
ABSTRACT
  
  Take-all, caused by Gaeumannomyces tritici, is one of the most important wheat root diseases worldwide, as it results in serious yield losses. Carabrone, a botanical bicyclic sesquiterpenic lactone isolated from Carpesium macrocephalum, which is widely distributed in Asia and Europe, is a promising fungicidal agent that is environmentally friendly and can effectively control G. tritici. However, the mechanism of action of carabrone against G. triticiremains largely unclear. In our previous study, we identified the mitochondria as the subcellular location of carabrone by confocal microscopic detection of a fluorescently-labeled molecule, and carabrone has a significant effect on biological oxidation. With G. tritici as the target organism, this study has confirmed the antifungal activity of carabrone against G. tritici and completed the histopathology observation on the strain after treatment by carabrone. Then with antimycin A as a positive control, we performed the research on effects on mitochondrial respiratory chain by carabrone. Finally, we explored the functional analysis of genes GgCytc1, GgCytb, and GgIsp of the mitochondrial respiratory chain cytochrome bc1 complex in G. tritici by RNA silencing and overexpression as a possible target of carabrone. Following results were obtained:
  
  1. The activity of carabrone against G. tritici was confirmed. The potentiation of the effect of carabrone in G. tritici by salicylhydroxamic acid (SHAM) was measured as well. Carabrone resulted in significant inhibition of G. tritici with EC50 value of 40.30 ?g/mL. For mixture of carabrone and SHAM (1:3), the value of CTC was 146.1, which is significantly greater than 120, indicated that the mixture of carabrone and SHAM against G. tritici showed a synergistic effect, and carabrone has a significant inhibition on mitochondrial respiratory chain in G. tritici.
  
  2. The activity of mitochondrial respiratory chain complexes I, II, III, IV, V, I+III, II+III and citrate synthase (CS) was measured, and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis was performed when treated with carabrone. The activity of respiratory chain complexes I-V were inhibited, especially complex III, I+III and II+III, and the activity of CS did not change significantly. Compared with the control, the activity of complex III (30, 60 and 87%, respectively), complex I+III (26, 45 and 76%, respectively) and complex II+III (50%, 60% and 85%) decreased significantly following treatment with carabrone at EC30, EC50 and EC70. The activity of complexes III, I+III and II+III in G. tritici were approximately negatively correlated with the treatment of carabrone in concentration and time. The gene GgCyc of respiratory chain complex III in G. tritici was highly sensitive to carabron by qRT-PCR. These results declared that respiratory chain complex III in G. tritici is highly sensitive to carabrone.
  
  3. An optimised polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation system for G. tritici was established, and the genes of hygromycin phosphotransferase were
  
  transformed to G. tritici. The final optimized conditions were determined to be: 1 mL of 1.4% lysing enzyme reacting with 0.035 g of hyphae at 31?C for 2.2 h at 90 rpm. The yield of protoplast was 9.83 × 107 protoplasts/mL, and the protoplast vitality was high, reaching 96.27% under the optimized conditions. Under the optimal conditions, the genes of hygromycin phosphotransferase were successfully inserted into the genome of G. tritici, with the highest transformation frequency (46–54 transformants/?g DNA)。 The establishment of protoplast transformation laid a foundation for the construction of mutants' bank of G. tritici.
  
  4. The genes GgCytc1, GgCytb, and GgIsp of the mitochondrial respiratory chain complex III in G. tritici were silenced and overexpressed, and mutants were successfully obtained.The growth rate, colony morphology and sensitivity to carabrone and H2O2 of the wild type strain and mutants were determined. The results showed that the silencing mutants ?GgCytc1、?GgCytb and ?GgIsp has less sensitive to H2O2, and that the hyphae were thin with hyphal branching reducing compared with the wild-type strain and the overexpression mutants. The silencing mutant ?GgIsp is less sensitive to carabrone with EC50 value of 156.18 ?g/mL, and the overexpression mutant OEIsp is significantly sensitive to carabrone with EC50value of 25.88 ?g/mL. The results declared that GgIsp is sensitive to carabrone and the subunit Rieske is a potential target of carabrone.
  
  5. The activity of peroxidase, laccase, and mitochondrial respiratory chain complex III, melanin concentration, pathogenicity, and the rates of mitochondrial respiration in the wild type strain and the mutants were assessed. (1) Compared with the wild-type strain and overexpression mutants, the production of melanin in the strain treated with carabrone (100 μg/mL), silencing mutants ?GgCytc1, ?GgCytb, ?GgIsp, and carabrone-resistant isolate 24-HN-1 (Laboratory preservation) were significantly increased (50-100%)。 (2) The activities of laccase were significantly inhibited in ?GgCytc1, ?GgCytb, ?GgIsp and 24-HN-1 (47, 37, 41, and 44%), which was consistent with pathogenicity. The activity of peroxidase was significantly increased in wild type strain and the mutants, except for ?GgIsp, when treated with carabrone (EC80)。 (3) The activities of respiratory chain complex III of wild type strain and mutants were significantly decreased, except for ?GgIsp and 24-HN-1, when treated with carabrone (0, EC20, EC80) in vitro and in vivo. (4) Following treatment with antimycin A (20μg/mL), the rates of mitochondrial respiration of the ?GgCytb had no signicant change, and other strains were significantly inhibited. The rates of mitochondrial respiration of the wild-type strain, ?GgCytc1, ?GgCytb, 24-HN-1, OECytc1, OECytb, and OEIsp were significantly inhibited following treatment with carabrone at EC80 (approximately 81, 77, 79, 57, 72, 73, and 72%, respectively), while ?GgIsp had no effect compared with the control. The results declared that ?GgIsp is insensitive to carabrone and the subunit Rieske is a potential target of carabrone.
  
  6. With 3D structure of Saccharomyces cerevisiae respiratory chain complex III cytochrome c1 (Cytc1), cytochrome b (Cytb) and Rieske (ISP) subunit as template, homologous modeling of Cytc1 and ISP subunit from G. tritici, and Cytb subunit from Neurospora crassa were conducted through the Swiss Model software. Based on the reliable homologous model, active binding cavities of Cytc1, Cytb and ISP subunit were predicted. Then, the carabrone were docked flexibly with the binding cavities in Cytc1, Cytb and ISP respectively, and eight amino acid residues (Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166 and Tyr230) were the important binding sites to combine carabrone.
  
  In conclusion, this study proposed the mechanism of carabrone against G. tritici as following: carabrone enriched in the mitochondria, which affected the respiratory chain complex III, leading to electrons were unable to transfer, then lots of ROS were generated by respiratory chain complex III. More ROS would be accumulated in mitochondrial, and a series of oxidative stresses were produced. Finally, apoptosis factor was released in mitochondria, causing cell death of G. tritici.
  
  KEY WORDS: carabrone, Gaeumannomyces tritici, mitochondrial respiratory chain, cytochrome bc1, RNAi

目 录

  第一章文献综述
  
  1.1小麦全蚀病研究概况
  

  小麦全蚀病是由小麦全蚀病菌(Gaeumannomycestritici)引起的,又称为小麦立枯病、黑脚病。小麦全蚀病是一种典型的土传根部病害,病菌菌丝从小麦的根部和茎基部1-2节侵入,在根部进行大量繁殖,导致根部导管堵塞,不能正常运输营养和水分,使麦株黄叶增多,分蘖减少。全蚀病菌在小麦的整个生长期均可侵染,苗期病株矮小,下部黄叶多,种子根和地中茎变成灰黑色,严重时造成麦苗连片枯死。拔节期冬麦病苗返青迟缓、分蘖少,病株根部大部分变黑,有时候在茎基部及叶鞘内侧出现较明显灰黑色菌丝层。成株期的症状比较明显,在小麦田形成矮化中心,分蘖明显减少,并且提前成熟,在小麦抽穗期出现典型的“白穗”症状。由于病株的养分和水供应不足,多呈现出矮小,穗数少且不实,千粒重明显降低,造成减产,一般减产达20-50%左右,严重着甚至绝收。
  
  1.1.1小麦全蚀病的发生和危害
  
  小麦全蚀病首次是1852年在南澳大利亚发现的,直到1870年被命名为全蚀病,目前是全世界小麦种植区小麦上最严重的土传根部病害(AsherandShipton1982;Cook2003)。我国最早在1931年浙江小麦种植区发现全蚀病,之后在全国小麦种植区均有发现(高照良和商鸿生1999)。小麦全蚀病菌也会导致大麦、黑麦和相关禾草的根腐病,但对小麦引起的危害最为严重。研究者对小麦全蚀病菌的研究比较早,也比较多,早在二十世纪中期Garrett就推出将根部病害和土传病原菌的研究作为一个独立的科学领域(AsherandShipton1982;Garrett1956)。长期以来,小麦全蚀病在我国小麦种植区危害较为严重,造成严重减产。因此,深入了解小麦全蚀病的发生规律以及防治措施,进一步明确小麦抗病机制与病菌致病机制,对于控制小麦全蚀病危害具有重要意义。
  
  1.1.2全蚀病菌研究概况
  
  小麦全蚀病菌(Gaeumannomycestritici)是禾顶囊壳小麦变种,属于子囊菌亚门真菌,是土壤寄居菌,只能在土壤中的病残体上腐生或休眠,过度到下季小麦上,完成其侵染循环。同时,在小麦成熟前或收获后,病茬上产生大量有性世代-子囊壳,在潮湿或有微雨的条件下,子囊壳破裂喷射出大量的子囊孢子,其中一部分子囊孢子落于本田,另一部分随气流带往其他田地,其传播方式和病残体也不尽完全相同,在自然条件下尚未发现其无性阶段。小麦全蚀病菌在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上菌丝为褐色,菌丝束明显,人工培养易产生子囊壳,其主要靠菌丝侵染寄主,在苗期和成株期均可发病。小麦全蚀病菌能引起严重的小麦根部病害,在全世界小麦种植区发生较为普遍,病原菌感染易感宿主,导致植株根系发黑,严重矮化和过早死亡等。全蚀病菌不仅能侵染小麦、黑麦、大麦和燕麦还可以侵染禾本科杂草或谷物的根导致黑脚病(Cook2003;McMillanetal.2015;Keenanetal.2015)。
  
  小麦全蚀病菌能引起禾谷类作物严重的根部病害,其分类水平一直是几十年来研究的课题。根据形态学、致病性和寄主选择性,可以分为四个变种(Turner1940;Walker1972;Yao1992)。小麦全蚀病菌禾谷变种(G.graminisvar.graminis(Ggg)),能引起水稻冠(黑)鞘腐病,狗牙草顶枯病和根腐病以及奥古斯丁或其他暖季型草坪草的根系衰退(Walker1972;Elliott1991;WardandBateman1999)。Ggg是最没有侵略性的变种,经常被发现腐生在谷物,草和大豆中的一个致病力较弱的病原菌(Walker1980;Royetal.1982;WardandBateman1999)。小麦全蚀病菌燕麦变种(G.graminisvar.avenae(Gga))能引起燕麦和草坪全蚀病,也能侵染小麦、黑麦和大麦。小麦全蚀病菌小麦变种(G.graminisvar.
  
  tritici(Ggt))是最具侵略性的变种,是引起小麦全蚀病的主要变种。它主要侵染小麦,同时,也可以侵染小黑麦、大麦和燕麦等谷物和草(Walker1980;WardandBateman1999;FreemanandWard2004)。小麦全蚀病菌玉米变种(G.graminisvar.maydis(Ggm))能引起玉米全蚀病,也能轻微侵染高粱等谷类(Yao1992)。上述小麦全蚀病菌变种的分类是根据不同的病菌侵染寄主后的症状、病菌的寄主范围、培养条件和病菌的形态特征等,但是这种分类过程繁杂且耗时,在许多情况下是不确定的。直到2016年,研究者在利用ITS(5.8SrDNA和28SrDNA基因间隔序列)的扩增等方法发现Ggt和Gga变种不同于G.graminis,并且将G.graminisvar.tritici和G.graminisvar.avenae分别重新命名为G.tritici和G.avenae(Hernández-Restrepoetal.2016)1.1.3小麦全蚀病的防治方法小麦全蚀病的侵染源主要来源于土壤,其与小麦长期的共生,且寄主范围较广,病害一旦发生就难以根治。小麦全蚀病菌是一种非专化寄生菌,对小麦品种并无严格选择性,难以培育出抗性良好的高抗品种,且至今为止,国内外市场上并没有对该病防治效果很好的杀菌剂。因此,在农业生产中,首先,要严格控制好检疫。其次,种植高产耐病品种。最后,加强栽培管理,适当的进行轮作,根据麦田土壤和气候的不同,从作物、小麦或其他易感的禾本科作物轮作一年或二年,也可以通过连续种植小麦和大麦来管理,导致小麦全蚀病的发病率自然下降,恢复作物的产量(ThomashowandWeller1988)。
  
  在生物防治方面,荧光假单胞菌和木霉菌对小麦全蚀病菌均有一定的抑制作用。同时,提倡施用沤制的堆肥,采用配方施肥技术,增加土壤根际微生物。在化学防治方面,迫切的需要一种能有效防治小麦全蚀病菌,并且低毒、对环境友好的新型杀菌剂。
  
  1.2植物源杀菌剂研究进展
  
  从植物中提取和分离出活性物质是创制新农药的一个重要途径,也是目前的一个研究热点。植物源杀菌剂通常是由多种不同作用方式的混合物构成,对病原菌是多作用位点,因此,不易产生抗药性(BrentandHollomon2007;MiresmailliandIsman2014)。
  
  据报道,全球有6300多种高等植物具有防治有害生物的潜力,其中杀菌植物2000多种(于宏伟等2009)。我国是一个植物资源大国,具有很大优势开发植物源农药。国外研究者对植物源活性物质也进行了大量的研究。在欧洲,虎杖(Reynoutriajaponica)的提取物被用来广泛防治真菌,该提取物对白粉病特别有效,通过诱导植物防御机制来达到保护植物作用,该提取物的主要活性化合物是大黄素类物质(Dayanetal.2009)。Singh等1983年发现,大蒜Alliumsativum、印楝Azadirachtaindica和姜Zingiberofficinale对豌豆白粉病Erysiphepolygonl有很好的活性(SinghandSingh1983)。Karade研究发现,薄荷叶Menthaarvensis提取物对链格孢菌Alternariaalternata有很好的活性(KaradeandKalekar2000)。目前,我国很多科研机构和企业都在进行植物源农药的开发研究,并且已经有多种植物源活性成分的杀菌剂取得登记,如0.6%苦参碱水剂、0.8%大黄素甲醚悬浮剂、1%蛇床子素水乳剂、4%小檗碱水剂、0.28%[0.16%+0.12%]黄岑苷·黄酮水剂、2.1%[2%+0.1%]丁子香酚·香芹酚水剂、0.05%大蒜素浓乳剂等。
  
  1.2.1抑菌植物的筛选
  
  1.2.1.1抗真菌植物的筛选

  
  细辛Asarumsieboldii是马兜铃科细辛属的植物,在1970年描述的日本细辛属植物中,无疑是一个以其独特的花结构而闻名,在其属中是最不寻常的物种之一。在我国,细辛主要分布在云南、四川、陕西、辽宁、黑龙江、浙江等地,多生长在林下潮湿的腐殖中。早在《神农本草经》中有记载,细辛是常用中药。王树桐等在2004年研究发现,细辛和丁香的醇提物对番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)有较强的抑制作用(王树桐等2004)。研究发现,丁香Syringaoblata、细辛A.sieboldii、甘草Glycyrrhizauralensis、黄连Coptischinensis、苦参Sophoraflavescens、蛇床子Fructuscnidii对辣椒疫病菌Phytophthoracapsici、番茄灰霉病菌B.cinerea、茄黄萎病菌Verticilliumdahliae、黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum和黄瓜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum的菌落生长有明显的抑制作用(黄奔立等2006)。张淑红等(2006)研究表明,细辛提取物对茄黄萎病菌V.
  
  dahliae的菌丝生长抑制作用较强,抑制效果在65%以上。蛇床子F.cnidii为伞形科植物,一年生草本植物,其果实在医学上有广泛的应用,具有许多抗炎、抗肿瘤的作用,其是多年生草本植物的重要传统药材,广泛用于皮肤和妇科疾病(Wangetal.2008)。据报道,蛇床子甲醇提取物对须发癣菌有较强抑制作用。余伯阳等(1991)年研究发现,蛇床子水煎液对羊毛状小孢子Microsporonlanosum和絮状表皮癣菌Epidermophytonfloccosum有抑制作用。周宝利等(2012)研究发现,蛇床子水提物对番茄灰霉病菌B.cinerea的菌丝抑制效果最差,而醇提物对番茄灰霉病菌的菌丝抑制效果较好。同时,具有杀真菌的植物还有小蘖Berberiskawakamii、姜Z.officinale、桉树Eucalyptusrobusta、金盏花Calendulaofficinalis等。
  
  1.2.1.2抗细菌植物的筛选
  
  夹竹桃Neriumoleander是一种夹竹桃科的常绿灌木或小乔木,具观赏价值的中草药。原产于非洲北部和地中海地区,广泛种植于温带和亚热带地区,花期较长,耐高温、耐盐和耐旱。许多品种是根据其单花或双花的颜色选择的,也有完全绿色和多年生的品种(Vilaetal.2010)。夹竹桃在医药方面研究较深,能产生具有生物活性的次生代谢物,主要是胡萝卜苷、黄酮和萜类化合物,因此对制药工业具有重要的经济意义(Fuetal.2005)。夹竹桃苷已被确定为一种有效的抗肿瘤化合物。研究者利用夹竹桃叶提取物对大肠埃希氏菌Escherichiacoli、普通变形杆菌Proteusvulgaris、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、粪肠球菌Enterococcusfaecalis、八叠球菌Sarcinalutea的活性进行测定,发现夹竹桃叶醇提取液的抑菌效果最好,其中浓度70%乙醇提取液的抑菌效果最为明显。夹竹桃对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和八叠球菌的抑制作用比较明显。研究表明,夹竹桃叶提取物对革兰氏阳性菌具有较强的抑菌效果,而对革兰氏阴性菌的抑菌作用不显着(李昌灵等2008)。穿心莲Andrographispaniculata的主要成分为甾醇、生物碱、内酯、黄酮类化合物以及少量蛋白质和维生素。Singha等(2003)研究发现,穿心莲的水提物对枯草杆菌Bacillussubtil、金色葡萄球菌S.aureus、大肠杆菌E.coli、绿脓假单胞菌Pseudomonasaeruginosa和白念珠菌Candidaalbicans有显着抑制作用。同时,有研究表明,穿心莲提取物对金色葡萄球菌S.aureus、枯草杆菌B.subtil、大肠杆菌E.coli、黑曲霉Aspergillusniger、青霉Penicillium都有抑菌效果,而且对细菌的抑制效果强于真菌(刘志祥等2009)。具有杀细菌的植物还有大蒜A.sativum、荆芥Fineleafschizonepeta、仙鹤草Agrimoniapilosa、洋葱Alliumcepa、半枝莲Scutellaruabarbata等。
  
  1.2.1.3抗病毒植物的筛选
  
  商陆Phytolacca属多年生粗壮草本植物。在我国河南、湖北、山东、浙江、江西等地区均有分布,我国现有分布的品种中主要有商陆和垂序商陆(美商陆,美洲商陆,十蕊商陆),商陆的主要有效成分包括多种皂甙、商陆碱、商陆素及硝酸钾等。据研究发现,美洲商陆是首次发现含有病毒抑制剂的植物。虽然其他物种如甜菜Betavulgaris、菠菜Spinaciaoleracea、洋石竹Dianthuscaryophyllus等的汁液中的物质也会抑制植物病毒传播,但商陆提取物可能是迄今为止对病毒最有效的植物源活性物质(Tomlinsonetal.1974)。Lin研究发现,美商陆能产生三种商陆抗病毒蛋白(Phytolaccaanti-viralprotein,PAP)。从叶中分离出29kDaPAP和30kDaPAP-II,从商陆的种子中分离出30kDaPAP-S;研究表明PAP在商陆的整个生长发育期都在不断合成,而PAP-II随着商陆年龄的增加才合成(Linetal.1991)。葛永辉等(2013)研究发现,垂序商陆果实和枝叶的正丁醇萃取部分,枝叶的乙酸乙酯萃取部分提取物对烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)表现出了一定的钝化作用,含有4个三萜皂苷类化合物的组分具有较强的体外抑制TMV增殖作用。具有抗病毒的植物还有银杏Ginkgobiloba、甘草G.uralensis、连翘Forsythiasuspensa、红花马齿苋Portulacasplendens、红叶藜Chenopodiumrubrum等。
  
  1.2.1.4杀线虫植物的筛选

  
  万寿菊属植物Tagetes,是菊科中的一个属,为一年生、分枝、直立或披散草本植物。
  
  该属共有46种植物,分布于热带美洲,其中有14种可防治线虫。Rajvanshi报道,万寿菊中的T.patula的水提物中有一种碱性的化学成分,能有效的抗线虫(Rajvanshietal.1985)。万寿菊属植物中的T.erecta、T.minuta均能很好的防治多种线虫,Mateeva等作了相关研究,这些植物对控制线虫严重发生与危害,减轻环境污染等起了很大作用(Mateeva1995)。Nandal(1986)研究发现,用蓖麻Ricinuscommunis叶提取液灌根,可有效的防治爪哇根结线虫Meloidogynejavanica,减少了线虫对植株根的损伤。同时,具有杀线虫的植物还有印楝A.indica、苦郎树Clerodendruminerme、侧柏Platycladusorientalis等。
  
  1.2.2植物源抑菌活性成分的研究进展
  
  从抑菌植物中提取分离的活性成分结构类型有:萜类、生物碱类、黄酮类、酚类、醇类等。大多数抑菌植物中同时含有几种不同类型的活性成分物质。萜类化合物的抑菌作用研究较多。辐射松(Pinusradiata)、黄芩属(Scutellaria)、常山(clerodenrumuncinatum)和天明精属(Carpesium)等中提取分离到萜类化合物(Coleetal.1991)。Picman(1986)研究发现,60%以上的倍半萜类化合物具有很好的抑菌活性。生物碱是分布最广的含氮次生代谢物,存在于约20%的有花植物中(WippichandWink1985)。目前,研究较多的具有抑菌作用的生物碱有小檗碱、喹嗪生物碱、芦竹碱等,分别从黄连、羽扇豆、芦竹等植物中提取分离得到。黄酮类具有很强的抑菌活性,如从刺桐(Erythrinavariegata)、甘草(Glycyrrhizauralensis)大豆黄(Glycinemax)和鹰嘴豆(Cicerarietinum)等植物中提取分离的黄酮类物质具有很好的抑菌活性。芒果皮、大蒜、茶叶、樱桃树等植物中分离得到的酚、醇类化合物如大蒜素、茶多酚、苯甲醇化合物等具有很好的抑菌活性。同时,从植物中提取分离得到某些脂肪和蛋白质类物质具有很好的抑菌活性(韩建华2002)。
  
  1.3倍半萜内酯类化合物研究进展
  
  萜类化合物在自然界中分布较为广泛,存在于多种植物与微生物的次级代谢产物中。
  
  倍半萜类化合物是由三分子异戊二烯单元聚合而来,含有内酯环的倍半萜称之为倍半萜内酯。倍半萜内酯类化合物多存在于木兰科、八角科以及菊科等多种植物中,是多种药用植物的重要活性成分(刘清华等2007;胡岩等2010;杨茜2012)。近年来国内外研究表明,倍半萜内酯类成分在强心、抗肿瘤、抗炎、抑菌等方面均具有较好的生物活性(Barsbyetal.1993;Evstratovaetal.1974;Huangetal.2013)。研究发现α-亚甲基-γ丁内酯环是倍半萜内酯的有效基团,迄今为止发现较多的倍半萜内酯类化合物具有良好的生理活性,是研究和开发新药的重要来源。新农药的创制的重要途径之一便是对天然产物的研究与利用,除了直接将其开发成农药外,更重要的是发现和确证结构新颖的天然产物的分子靶标,为新农药的分子设计提供支持。倍半萜内酯类植物次生代谢产物的结构类型丰富、化合物数量庞大、生物活性多样,是植物自身产生的典型的先天防御物质(phytoanticipin),在新农药创制上具有重要潜质(Dixon2001;Chadwicketal.2013)。
  
  1.3.1倍半萜内酯类化合物生物活性研究进展
  
  倍半萜内酯是菊科植物中最具特色的次生代谢产物,同时,在爵床科、苋科、伞形科和木兰科这几个植物科中也曾报道过。倍半萜内酯类化合物具有多种化学结构和广泛的生物活性,包括抗肿瘤、昆虫拒食、植物生长调节、抗细菌、抗真菌和细胞毒性等(Baruahetal.1994;G?renetal.1996;MansillaandPalenzuela1999;Neerman2003)。异土木香内酯(isoalantolactone)是一类倍半萜类化合物,是总状土木香Inularacemosa(菊科)中的主要成分。同时,发现异土木香内酯对3种土壤植物病原真菌小麦全蚀病菌G.tritici、小麦纹枯病菌Rhizoctoniacerealis和辣椒疫霉病菌P.capsici具有很好的抑制作用(Mishra2001)。Ahmed和Abdelgaleil从荷花玉兰Magnoliagrandiflora中分离得到的倍半萜内酯为广木香内酯(costunolide)、小白菊内酯(parthenolide)以及1,10-环氧基-小白菊内酯(1,10-epoxyparthenolide)。通过试验测定表明,广木香内酯对黑孢子菌Nigrosporaspp、立枯丝核菌Rhizocotoniasolani和长蠕孢属Helminthosporiumspp的抗真菌活性最强,EC50值分别为0.48、2.92和2.96?g/mL.而小白菊内酯对链格孢菌A.alternata和镰刀菌Fusariumculmorium表现出较高的抗真菌活性,EC50值分别为4.07和50.27?g/mL.这三种倍半萜内酯类化合物对长蠕孢属Helminthosporiumspp的抗真菌活性均高于对照杀菌剂甲基托布津(thiophanate-methyl)(AhmedandAbdelgaleil2005)。
  
  Kumari等从树斑鸠菊(Vernoniaarborea)中分离得到的倍半萜内酯zaluzaninD,并对该化合物进行了抗真菌活性研究。表明其对灰葡萄孢菌B.cinerea、月状弯孢菌Curvularialunata以及立枯丝核菌Rhizoctoniasolani有很好的抑菌活性(Kumarietal.2003)。去氢木香内酯(dehydrocostuslactone)属于愈创木烷型倍半萜,对6种植物病原物真菌的孢子萌发有强烈抑制作用(Wedgeetal.2000)。Calera等从一种墨西哥菊Ratibidamexicana中分离得到的isoalloalantolactone和另一种桉烷型化合物,并对其进行抑菌活性测定,发现这两种倍半萜内酯对不同的镰刀菌属真菌、腐霉属真菌和长蠕孢属真菌的菌丝生长有很好的抑制作用(Caleraetal.1995)。目前,已报道的具有杀菌活性的倍半萜内酯类化合物多为吉玛烷型、愈创木烷型、伪愈创木烷型、桉叶烷型和卡拉布烷型倍半萜。
  
  1.3.2倍半萜内酯类化合物作用机制研究进展
  
  倍半萜内酯类化合物广泛存在于植物、微生物、及某些昆虫体内,具有多种生物活性。目前,有关倍半萜内酯类化合物的作用机制在医药上已有较深入的研究。研究发现,有些倍半萜内酯具有较强的抗炎、抗肿瘤活性,α-亚甲基-γ-丁内酯结构环是倍半萜内酯具有抗肿瘤活性的有效基团。倍半萜内酯影响转录因子和许多酶系统导致细胞毒效应,对细胞内各种靶结构造成干扰(Schmidt1999;SchmidtandHeilmann2015)。倍半萜内酯中的α-亚甲基-γ-内酯活性基团发生亲电加成反应以及细胞内硫醇的亲核反应构成这个细胞毒性的分子机制(Hanetal.2009;Liuetal.2009)。小白菊内酯的抗炎作用可能与转录因子kappaB(NF-Кb)的抑制有关。蛋白NF-Кb是人类免疫应答的中心介质,在大多数细胞类型中,这种蛋白由一个p50和一个p65亚基组成。NF-Кb通过调节细胞因子及其受体、细胞黏附分子、环氧合酶Ⅱ和诱导型一氧化氮合酶等多种炎症介质和炎症因子的表达,在调节炎症过程中起关键作用(KarinandDelhase2000)。大多数转录因子NF-Кb抑制剂具有两个反应中心,分别是α-亚甲基-γ-丁内酯和α,β-或α,β,γ,δ-不饱和羰基。研究结果表明,小白菊内酯不仅抑制DNA和NF-Кb的结合,还抑制IКB-激酶活性,但前者在抑制中起了主要作用(García-Pi?eres2004)。Rüngeler等选择了28种倍半萜内酯类化合物包括吉玛烷型、愈创木烷型、伪愈创木烷型、桉叶烷型和苍耳烷型等结构类型,测定化合物抑制NF-Кb的能力。试验揭示了倍半萜内酯类化合物抑制转录因子NF-Кb通过选择性烷基化其p65亚基,可能与半胱氨酸残基反应(Rüngeleretal.1999)。小白菊内酯对微管蛋白羧肽酶有一定的抑制作用,该化合物的这种抑制作用是一种新的、特别的属性,与其对核因子NF-Кb通路的作用无关。微管蛋白羧肽酶的抑制可能是小白菊内酯抗癌特性的潜在机制之一(Fonroseetal.2007)。广木香内酯和小白菊内酯均可以显着抑制分泌型碱性磷酸酶,广木香内酯也可以抑制NF-Кb与DNA的结合并呈剂量依赖性(王毅2002)。同时,广木香内酯还抑制AP-1转录因子的活性,抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的磷酸化(Kangetal.2004)。目前为止,倍半萜内酯类的化合物杀菌和抗癌作用靶点尚不明确,但这些化合物中含有的α-亚甲基-γ-丁内酯结构与其生物活性有关。
  
  倍半萜内酯类化合物在农用中较少,目前报道的有小白菊内酯对水稻白叶枯病菌的抑菌作用。Xu等(2018)研究了小白菊内酯对水稻白叶枯病菌的抑制效果,离体条件下,小白菊内酯对水稻白叶枯病菌抑制效果较强,活体条件下该化合物对水稻白叶枯病菌有一定的治疗作用,但保护作用一般。通过研究小白菊内酯对水稻白叶枯病菌的抑菌机制,表明小白菊内酯能够与病菌中的谷胱甘肽和半胱氨酸等具有游离巯基的化合物发生反应,扰乱菌体还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽平衡,造成氧化胁迫,从而起到抑菌作用。
  
  1.3.3天名精内酯酮研究现状
  
  天名精内酯酮(图1-1)是从菊科天名精属大花金挖耳Carpesiummacrocephalum中分离提取得到的一种主要抑菌活性成分,大花金挖耳广泛分布于亚洲和欧洲(Minatoetal.1964;Fengetal.2010;Zhangetal.2015)。天名精内酯酮为卡拉布烷型倍半萜内酯类化合物,其特有的三元环桥连六元环的结构特征和优异的生物活性在新农药创制上具有重要潜质(冯俊涛2006)。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心首次报道了天名精内酯酮对小麦全蚀病菌G.tritici、灰霉病菌B.cinerea、炭疽病菌Colletotrichumlagenarium、枯萎病菌F.oxysporum、小麦纹枯病菌R.cerealis、辣椒疫霉P.capsici等19种植物病原真菌有很好的抑制效果,尤其是对小麦全蚀病菌具有显着抑菌活性。王箐霞(2007)测定了天名精内酯酮对玉米大斑病菌Setosphaeriaturcicaa、番茄叶霉病菌Fulviafulva、黄瓜炭疽病菌等6种供试病原真菌孢子萌发的抑制作用,其中对黄瓜炭疽病菌的孢子毒力最高,EC50为6.9mg/L.通过盆栽试验,表明天名精内酯酮对小麦全蚀病、小麦白粉病、辣椒疫霉病和黄瓜炭疽病具有很好的保护和治疗效果,其中对小麦全蚀病的药效较好,在1000mg/L剂量下,对小麦全蚀病的保护和治疗的效果为85.48%和64.98%;其次,对小麦白粉病的保护和治疗效果为73.68%和46.95%;对黄瓜炭疽病的保护和治疗效果为50.01%和46.49%;对辣椒疫霉病的保护和治疗效果为48.06%和39.75%.在室内盆栽试验基础上,通过天名精内酯酮灌根法防治小麦白粉病,在1000mg/L的剂量下,保护和治疗效果分别为80.43%和82.69%;通过活体组织法测定发现,在1000mg/L剂量下,天名精内酯酮对番茄灰霉病的保护和治疗效果分别为45.5%和19.9%(冯俊涛2006;王艳梅2009;韩兴帅等2014)。试验表明天名精内酯酮具有良好的保护和治疗效果并且有较优的内吸性及向上传导性。
  
  冯俊涛等(2007)通过对天名精内酯酮结构式中可能的活性基团进行修饰,发现该化合物分子中的α-亚甲基-γ-丁内酯结构和4位羰基结构对其活性有重要影响,是其活性基团。天名精内酯酮不仅对供试菌株有显着抑制作用,还具有较低毒性、环境友好等特点(Fengetal.2010;Wangetal.2014a,2014b),因此,该化合物有潜力开发为一种新型的植物源杀菌剂。考虑到天名精内酯酮结构的独特性和对环境的友好性,通过开展该化合物的分子靶标研究工作,不仅能以此为模型的农药分子设计提供靶标上的支持,而且还可以发掘天然产物的利用潜力,提升对天然活性物质的利用水平。
  
  杀菌剂作用机理的研究为化合物的应用和新农药创制奠定基础,课题组前期就天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的抑菌机理进行了初探。通过高效液相色谱法检测发现天名精内酯酮在双子叶作物黄瓜和单子叶作物小麦中具有较优的内吸活性,并且从根部向上传导。生理生化研究结果表明,天名精内酯酮对小麦全蚀病菌生物氧化过程存在显着影响。
  
  通过超微结构观察发现天名精内酯酮对病原真菌线粒体结构产生严重影响,天名精内酯酮处理病菌后,线粒体发生肿胀、脊消失使其空泡化、出现髓鞘样结构等(冯俊涛2006;王艳梅2009)。同时,利用荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫金法亚细胞定位,表明天名精内酯酮在小麦全蚀病菌中作用的细胞器为线粒体(Wangetal.2018)

  1.4线粒体呼吸链研究现状

  线粒体是真核细胞中必不可少的细胞器,它是酶的机器-氧化磷酸化系统(OXPHOS),负责三磷酸腺苷(ATP)的有氧生产。线粒体内有重要的细胞反应,包括线粒体呼吸链能量的产生、调节细胞死亡、钙代谢和活性氧产生。三羧酸循环又称为柠檬酸循环(TCAcycle)是发生在线粒体中重要代谢途径,是糖类、脂类和氨基酸的联系枢纽和共同代谢途径。三羧酸循环中产生的NADH和FADH2进入电子传递链产生大量的ATP.
  
  线粒体呼吸链由五个复合酶(复合酶I-V)嵌入线粒体内膜,催化Krebs循环与氧反应产生的高能化合物的还原等价物的转移,最终通过线粒体内膜产生电化学梯度,驱动ATP合成酶合成ATP.如图1-2,线粒体电子传递链中,有两条呼吸途径,即电子从呼吸链复合酶I→泛醌(Q)→复合酶III→细胞色素c→复合酶IV或者电子从呼吸链复合酶II→Q→复合酶III→细胞色素c→复合酶IV.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原型黄素二核苷酸(FADH2)产生的电子通过呼吸链复合酶I到IV,最终传递给氧气。
  
  呼吸链复合酶Ⅰ至IV之间的电子转移涉及位于内膜内的移动电子载体泛醌和细胞色素c,细胞色素c是位于膜间间隙的一种小的非膜锚定蛋白。线粒体内膜的呼吸复合酶是由两种来源的蛋白质组成的多亚基复合体。大部分蛋白质编码于细胞核DNA中,在细胞质核糖体上合成,并导入线粒体。哺乳动物线粒体基因组编码13种疏水膜蛋白(表1-1),且这些膜蛋白均是线粒体内膜的呼吸链复合酶的亚基(Andersonetal.1981;Andersonetal.1982)。其中,呼吸链复合酶I中,有7个亚基由线粒体编码即ND1-ND6和ND4L,在牛线粒体中这7个亚基给复合酶I的膜臂上贡献约60条跨膜a-螺旋(Carrolletal.2006)。呼吸链复合酶Ⅲ中的11个亚基,只有细胞色素b亚基是线粒体DNA编码的,是复合体III的功能亚基(Iwataetal.1998)。呼吸链复合酶IV由13个亚基组成,其中亚基CoxI,CoxII和CoxIII由线粒体编码,且是呼吸链复合酶IV的催化核心(Tsukiharaetal.1996)。在呼吸链ATP合酶中,亚基ATPase-6和ATPase-8由线粒体DNA编码,它们构成了ATP合酶中Fo质子移位区的一部分(FearnleyandWalker1986;Chenetal.2007)。线粒体呼吸链功能障碍是人类多种疾病的关键因素,包括线粒体和核DNA突变引起的原发性线粒体疾病,如老化、糖尿病、癌症和药物毒性、以及一些神经退行性疾病,包括帕金森病和阿尔茨海默病(DimauroandSchon2003;Miróetal.2003;Balabanetal.2005;LinandBeal2006;Hauptmannetal.2009;ChandraandSingh2011;Szendroedietal.2012)。然而,线粒体改变的机制和导致代谢紊乱的途径仍有待确定。
  
  有相当多的证据表明,线粒体主要通过线粒体DNA(mtDNA)突变的积累、活性氧的产生、线粒体代谢异常和钙储存的改变而导致神经元老化和与年龄有关的神经退行性疾病(LinandBeal2006;Reddy2008)。线粒体也是细胞死亡的关键调节因子,程序性细胞死亡被认为在衰老中发挥着重要作用。细胞死亡也与其他几个与衰老有关的过程有关,包括:增加活性氧(ROS)生成,可能导致线粒体分裂,促进神经细胞死亡(Yoonetal.2006;Benardetal.2007);胞浆中Ca2+水平升高,线粒体Ca2+缓冲改变,这可能有利于引起线粒体去极化或增强线粒体通透性转变的激活(Satrústeguietal.1996;Crompton2004)。线粒体功能是生物体内代谢平衡的基础。线粒体除了将营养物质转化为能量分子ATP外,它还产生活性氧等中间产物,作为第二信使来介导信号转导和代谢。
  
  线粒体ROS的产生曾是传统衰老理论的核心,在这一理论中,ROS诱导的氧化损伤促进了衰老过程;因此,防止衰老可以通过抑制或清除体内ROS的措施(RistowandSchmeisser2011;GemsandDe2013)。低浓度的ROS是线粒体中一种信号分子,与最近研究一致,线粒体ROS可以作为第二代信使来改善代谢的稳态和信号传导,甚至延缓衰老的进程(RistowandSchmeisser2011)。线粒体中的ROS大部分来自于呼吸链复合酶I和III中,并且经过超氧化物歧化酶(SOD)分解为H2O2,一部分的H2O2直接通过线粒体膜或者是线粒体膜通透性转换孔释放到细胞基质中,另一部分的H2O2经过谷胱甘肽过氧化物酶以及过氧化氢酶等分解为H2O(图1-2)。
  
  1.4.1线粒体呼吸链复合酶研究现状
  
  1.4.1.1线粒体呼吸链复合酶I

  
  线粒体呼吸链复合酶I又称为NADH:泛醌氧化还原酶,是线粒体和许多细菌呼吸链的关键酶之一。呼吸链复合酶I通过膜将电子2H+/e-从NADH转移到泛醌(Galkin1999)。真核生物线粒体呼吸链复合酶I有35个以上的亚基,分子量约为1MDa,而最小细菌线粒体呼吸链复合酶I有14个亚基,分子量约为600kDa.在真核生物线粒体呼吸链复合酶I中发现的附加亚基被称为附属亚基或额外亚基,而与最小细菌线粒体呼吸链复合酶I相同的亚基被称为保守亚基。在过去的30年里,研究者做出巨大的努力确定不同物种线粒体呼吸链复合酶I的结构。线粒体呼吸链复合酶I是一个L型的分子结构,一个臂与线粒体内膜结合,另一个臂伸入到线粒体基质中(B?ttcheretal.2002)。
  
  呼吸链复合酶I是一种较大、多亚基膜蛋白,在电子显微镜下,呼吸链复合酶I结构表现出高度的变异。部分变化可以反映呼吸链复合酶I在其功能周期中构象谱的一部分。
  
  其他的变化可能来自被洗涤剂从膜上去除时或者在电子显微镜制样过程中,造成呼吸链复合酶I结构不稳定。由于对线粒体复合酶I的功能机制缺乏了解,Bostina曾试图通过添加抑制剂或底物来稳定电子显微镜中的线粒体复合酶I,但并未尝试成功(Bostina2004)。呼吸链复合酶I是一种高度动态的酶,在电子显微镜下制备时会呈现一系列的构象。为了获得呼吸链复合酶I结构,必须采用可靠的方法来分离不同的构象。通过利用随机圆锥重建技术,计算具有一致结构域呼吸链复合酶I的三维重构图。通过X射线晶体结构与嗜热栖热菌Thermusthermophilus呼吸链复合酶I的亲水臂相对应,确定了已知的氧化还原辅助因子的位置:一种非共价结合的黄素单核苷酸(FMN),两个[2Fe-2S]
  
  型铁硫中心,命名为N1a和N1b,5个[4Fe-4S]型铁硫中心命名为N3,N4,N5,N6a和N6b(SazanovandHinchliffe2006)。另一个命名为N7的[4Fe-4S]型铁硫中心仅存在于某些细菌中(Nakamaru-Ogisoetal.2005)。该结构支持这样的观点,即除了N1a和N7外,它们形成了一条途径,使电子从位于亲水臂末端的NADH结合位点转移到位于亲水臂和膜臂界面的一个或多个Q位点。在这条途径上,铁硫中心N4,N5和N6a的顺序目前正在探讨中(Yakovlevetal.2007;OhnishiandNakamaru-Ogiso2008),铁硫中心N1a接近FMN,但与主电子转移途径分离(IngledewandOhnishi1980)。呼吸链复合酶I由水溶性和膜结构域组成,前者含有FMN和8~9个铁硫中心,后者未发现氧化还原中心。目前,通过膜的质子转移与内部电子转移的耦合机制仍不清楚。在科学研究中通常将鱼藤酮作为呼吸链复合酶I的抑制剂。
  
  1.4.1.2线粒体呼吸链复合酶II
  
  线粒体呼吸链复合酶II又称为琥珀酸:泛醌氧化还原酶,是一个完整的膜蛋白复合酶,是三羧酸循环中催化琥珀酸盐氧化生成延胡索酸盐的关键膜复合物。在酵母中,线粒体呼吸复合酶II有四个亚基:两种亲水性蛋白质(铁硫蛋白,IP)和黄素蛋白(FP),以及两种跨膜蛋白(CybS和CybL)。琥珀酸盐氧化是将线粒体内膜上的泛醌还原成泛醇,作为呼吸电子传递链一部分,电子通过黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)从琥珀酸转移到泛醌。[2Fe2S]、[4Fe4S]和血红素组成了呼吸链复合酶II的主要部分(H?gerh?ll1997)。
  
  琥珀酸:泛醌氧化还原酶通常由可溶性催化二聚体和完整的膜区组成,可溶性催化二聚体由亚基A与共价结合的FAD辅助因子和亚基B组成,亚基B含有三个铁硫中心,即[2Fe2S]、[4Fe4S]和[3Fe4S](H?gerh?ll1997)。将复合酶II锚定在内膜上的整体膜区包含一个或两个带有或不含血红素基团的疏水肽。琥珀酸酯:泛醌氧化还原酶根据其疏水亚基和血红素基的数量可分为五种类型(A-E);线粒体琥珀酸酯:泛醌氧化还原酶属C型,含有一个血红素分子和两个跨膜蛋白:大细胞色素b结合蛋白(CybL或亚基C)和小细胞色素b结合蛋白(CybS或亚基D)(Lemosetal.2002)。Iverson等曾报道,只有原核生物琥珀酸:泛醌氧化还原酶的结构(类型B,D和C),与线粒体琥珀酸:泛醌氧化还原酶具有相似的酶功能(Iversonetal.1999;Yankovskayaetal.2003)。目前,仍在深入研究呼吸链复合酶II还原泛醌的机理以及呼吸链复合酶II与复合酶Ⅲ之间泛醌过渡的过程。
  
  1.4.1.3线粒体呼吸链复合酶III
  
  线粒体呼吸链复合酶III又称为细胞色素bc1复合体(泛醌-细胞色素c氧化还原酶),在生物体内以二聚体的形式存在,是线粒体和许多原核生物能量守恒电子传递链中一种完整的膜蛋白,有三个功能亚基主要负责电子的传递即细胞色素b,铁硫蛋白(ISP)和细胞色素c1亚基,其中细胞色素b亚基由线粒体DNA编码,细胞色素b亚基中含有两个b型血红素(bL/b566和bH/b562)(AndandGennis1994)。呼吸链复合酶III催化电子从泛醌转移到水溶性细胞色素c,这种电子转移与两个质子在氧化后线粒体膜上的转移相耦合。该复合酶中Q循环机制是一种定量解释质子与电子转运的机理,每两个电子从泛醌转移到细胞色素c,同时,四个质子从线粒体基质中转移到带正电荷膜的一侧(Trumpower1990)。电子在醌的氧化位点(Qo)发生了一个分叉电子转移反应,即第一个电子从Qo位点转移到铁硫蛋白,然后转移到细胞色素c1,从细胞色素c1转移到细胞色素c如图1-3.醌在Qo位点发生氧化时形成一个中间产物,半醌;第二电子从Qo位点转移到细胞色素b的血红素bL(b-566),然后转移到血红素bH(b-562),最后在醌的Qi位点,醌被还原为氢醌(QH2),氢醌再次进入醌的氧化位点Qo,这样不断的进行循环,就是Q的循环机制。因此,在Qo和Qi位点均有不同的抑制剂,甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等为Qo抑制剂,抗霉素A等为Qi抑制剂(Kotiahoetal.2008;Bartlettetal.2002)。
  
  铁硫蛋白即为含有铁硫簇的蛋白,铁硫簇是存在于生物体中最古老、最普遍的物质之一,是一类具有重要生物功能的金属酶,最主要作用是呼吸链电子的传递,还包括细胞信号传导、维持酶结构、基因表达与调控以及催化作用等。在线粒体呼吸链中复合酶I、II和III中均含有铁硫中心,复合酶I中含有8-9个铁硫中心,复合酶II中含有3个铁硫中心,复合酶III中含有1个铁硫中心,铁硫蛋白亚基活性中心是含有一个或者多个铁硫簇,而不是血红素。X射线晶体学研究表明,线粒体呼吸链复合酶III中铁硫蛋白的构象取决于晶体形态和结构以及Qo位点是否有抑制剂存在(Iwataetal.1998;Kimetal.1998)。复合酶III晶体结构表明,在不同抑制剂存在和不存在的情况下,铁硫蛋白外部结构域在配合物中呈现两种构象。在牛P6522晶体中,铁硫蛋白亚基是一个[2Fe2S]
  
  结构,靠近细胞色素c1,称为c1状态。然而,当标桩菌素存在的情况下,铁硫蛋白亚基靠近细胞色素b的血红素bL,称为b状态(图1-4)。标桩菌素为呼吸链复合体IIIQo位点的抑制剂(Zhangetal.1998;Hunteetal.2000)。在电子传递的基础上,研究者曾提出了一种适用于呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基的移动穿梭机制。铁硫蛋白最初在b状态,QH2在Qo位点把电子转移给氧化中心的[2Fe2S].铁硫蛋白紧接着旋转57o到c1状态,并将[2Fe2S]还原把电子转移到细胞色素c1(Iwataetal.1998;Zhangetal.1998)。
  
  这种移动穿梭机制得到了交联和突变研究的支持,该研究使铁硫蛋白固定或改变了颈部的构象(Xiaetal.1997;Xiaoetal.2000;DarrouzetandDaldal2002)。这两种铁硫蛋白构象与泛醌类似物抑制剂的三种结合位置,都符合Q循环电子转移与质子转移机制。因此,研究者认为细胞色素bc1复合物中电子转移机制需要一个与铁硫蛋白运动有关的剧烈构象变化(Zhangetal.1998)。
  
  1.4.1.4线粒体呼吸链复合酶IV
  
  线粒体呼吸链复合酶IV又称为细胞色素c氧化酶(COX),是线粒体电子传递链末端复合酶,能消耗有机体超过90%的氧气。呼吸链复合酶IV属于铜-血红素氧化酶家族,整个催化循环均参与质子的转运,其中每泵出膜间隙两个质子需要传递两个电子。哺乳动物呼吸链复合酶IV由13个亚基组成,其中亚基CoxI,CoxII和CoxIII位于催化核心,且由线粒体DNA编码(Tsukiharaetal.1996)。呼吸链复合酶IV在维持细胞内稳态和健康方面起着关键作用。研究表明,缺乏COX可以引起严重疾病,如亚急性坏死性脑病(Lombesetal.1991;Adamsetal.1997),线粒体肌病等(Wadaetal.1996)。此外,基因SCO2(合成细胞色素c氧化酶2)突变,导致致命性婴儿心脑肌病(Papadopoulouetal.1999)。心肌和骨骼肌线粒体具有独特的特性,通过复合酶IV调节呼吸(Rossignoletal.1999)。在正常生理条件下,呼吸链复合酶I、III和IV形成不同的超复合体,使底物之间的距离缩小,更有利于电子快速传递(Genovaetal.2003)。超复合体的另一个主要功能是增加呼吸链复合酶I、III和IV的稳定性和协助组装性(Sch?ggeretal.2004)。
  
  在一些线粒体呼吸链功能障碍的患者中,缺乏完全组装的复合酶III会导致复合酶I不稳定,表明呼吸链复合酶在超复合结构中存在对稳定性及其重要性(Ac??n-Pérezetal.2004)。
  
  1.4.1.5线粒体呼吸链复合酶V
  

  线粒体呼吸链复合酶V又称为ATP合酶或FoF1-ATP合酶,是细胞里一台出色的旋转发动机,把细胞中二磷酸腺苷和无机磷酸盐合成ATP的过程。呼吸链复合酶V是线粒体中必不可少的一种酶,在ATP产生和线粒体膜电位维持中起着重要作用(Zhouetal.2015)。ATP合酶由位于线粒体基质中的亲水催化单元F1和膜结构域Fo组成,后者锚定在线粒体内膜上,介导间接参与ATP合成的质子传导(Fillingame1999;Pedersenetal.2000)。Boyer曾说,“所有的酶都很漂亮,但ATP合成酶是最美丽的,也是最不寻常和最重要的酶之一”(Boyer1997)。ATP合酶可以被认为是由两个发电机组成的复合物-ATP驱动的F1发电机和质子驱动的Fo发电机,它们在相反方向旋转。ATP合酶合成ATP的能量来源于质子跨膜电化学势梯度(Mitchell1961)。呼吸链复合酶V合成的ATP支持几乎所有需要能量的细胞活动。ATP合成酶是地球上最普遍,最丰富的蛋白质之一,其合成ATP是生物界最普遍的化学反应。从大肠杆菌E.coli到植物和哺乳动物中,该酶是进化过程中最保守的酶之一(Kanazawaetal.1981;Walkeretal.1985;Hudsonetal.1987)。线粒体呼吸链复合酶V利用自身亚基的物理旋转作为催化形成ATP,这是一种新机制,不同于任何已知的酶。ATP合酶是一种结构复杂的大蛋白复合物(~500kDa),其主要部分由~3500个氨基酸组成的微型发动机(Abrahamsetal.1994)。研究表明,ATP合酶参与线粒体嵴形态的形成,为了增加线粒体合成ATP的能力,线粒体内膜折叠形成嵴。
  
  1.4.2线粒体活性氧的产生线粒体
  
  除了具有形成ATP的“经典”功能外,还在细胞凋亡、活性氮(RNS)和活性氧(ROS)生成、电信号传导和钙稳态等方面发挥着重要作用(Duchenetal.2008;Willemsetal.2008)。在大多数细胞中,线粒体是活性氧的主要来源,这是氧化磷酸化过程中的分子氧的不完全还原生成。ROS包括羟基自由基(?OH)、超氧阴离子(O2●?),以及原子分子如单线态氧(1O2)和过氧化氢(H2O2),虽然低浓度的ROS起着有益作用,但线粒体中活性氧的过度生成与病理条件有关(Sharmaetal.2012;Mu?ozetal.2015)。线粒体呼吸链产生的低浓度活性氧、氮物种以及其他来源的ROS和RNS通过氧化特定蛋白质上巯基作为氧化还原信号。并不是所有蛋白质的巯基都参与该过程,因为在生理浓度下,大多数蛋白质巯基与ROS和RNS没有明显的反应(WinterbournandHampton2008)。只有特定蛋白质巯基被认为能与ROS发生发应,多为那些可接触到的和低磷酸化靶蛋白分子上特定丝氨酸/苏氨酸的蛋白质巯基(Rhee2006)。活性氧产生与神经变性和衰老等病理改变有关,呼吸链复合酶I和III被鉴定为ROS产生的主要部位(Turrens2003)。研究表明,呼吸链复合酶I主要在线粒体基质中产生ROS(MiwaandBrand2003)。
  
  呼吸链复合酶III在线粒体内膜的两侧均产生ROS(Mulleretal.2004)。线粒体呼吸链复合酶III在抑制剂存在的条件下(如:抗霉素A和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等),在线粒体内产生大量ROS,而复合酶I在电子传递受阻的条件下以高速率产生ROS.多年来,呼吸链复合酶I电子传递链中的主要辅因子都被认为是ROS产生的场所如:黄素单核苷酸(GalkinandBrandt2005;KussmaulandHirst2006)、铁硫簇N2和N1a(Genovaetal.
  
  2001;Kushnarevaetal.2002),以及在泛醌还原过程中形成的半醌自由基(LambertandBrand2004)。同样的也有研究表明,ROS的主要来源是线粒体复合酶III中的泛醌氧化位点(Boverisetal.1976)。正常生理条件下的ROS可以促进细胞增殖和分化(Trachoothametal.2009),而过量ROS可以导致细胞中的脂质,蛋白质和DNA氧化损伤(Perryetal.2000)。因此,平衡ROS产生与消除对正常细胞的生长和存活至关重要。

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  1.5 呼吸链复合酶 III 抑制剂研究进展
  1.5.1 Qi位点抑制剂研究进展
  1.5.2 Qo 位点抑制剂研究进展
  1.6 问题的提出及论文设计思路

  第二章 天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶的影响
  2.1 材料方法

  2.1.1 供试材料
  2.1.2 主要仪器及设备
  2.1.3 试验方法
  2.1.4 结果统计与分析

  2.2 结果与分析
  2.2.1 天名精内酯酮与 SHAM 的增效作用
  2.2.2 天名精内酯酮对呼吸链复合酶 I、II 活性的影响
  2.2.3 天名精内酯酮对呼吸链复合酶 IV、V、CS 活性的影响
  2.2.4 天名精内酯酮对呼吸链复合酶 III、I+III、II+III 活性的影响
  2.2.5 呼吸链复合酶基因 qRT-PCR 分析

  2.3 讨论
  2.3.1 天名精内酯酮对呼吸链有显着的抑制作用
  2.3.2 天名精内酯酮与呼吸链复合酶 III 的互作有待深入研究
  2.4 小结

  第三章 小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系的建立
  3.1 材料方法
  3.1.1 供试材料
  3.1.2 供试设备及试剂
  3.1.3 试验方法

  3.2 结果与分析
  3.2.1 培养基对原生质体制备的影响
  3.2.2 温度对原生质体制备的影响
  3.2.3 酶对原生质体制备的影响
  3.2.4 酶解时间对原生质体制备的影响
  3.2.5 菌丝体重量对原生质体制备的影响

  3.2.6 摇床转速对原生质体制备的影响
  3.2.7 酶浓度对原生质体制备的影响
  3.2.8 原生质体产生条件的优化
  3.2.9 转化子筛选
  图 3-4 转化子在选择培养基上生长
  3.2.10 Southern 杂交和 PCR 验证

  3.3 讨论
  3.3.1 原生质体制备在 PEG 介导小麦全蚀病菌转化中至关重要
  3.3.2 原生质体浓度对丝状真菌转化率有重要影响
  3.4 小结

  第四章 Ggcytc1、Ggcytb、GgISP 沉默和过表达载体的构建及突变体筛选
  4.1 材料方法
  4.1.1 供试材料
  4.1.2 供试设备及试剂
  4.1.3 试验方法

  4.2 试验结果
  4.2.1 GgCytc1,GgCytb 及 GgIsp 基因鉴定及序列分析
  4.2.2 沉默和过表达载体 PCR 验证
  4.2.3 沉默和过表达转化子 PCR 验证
  4.2.4 沉默和过表达转化子 RT-PCR 验证

  4.2.5 沉默和过表达转化子 DNA 水平验证
  4.3 讨论
  4.4 小结

  第五章 突变菌株生理生化指标测定
  5.1 材料方法

  5.1.1 供试材料
  5.1.2 主要仪器及设备
  5.1.3 试验方法

  5.2 结果与分析
  5.2.1 菌丝生长速率测定
  5.2.2 菌株对天名精内酯酮和 H2O2 敏感性测定
  5.2.3 菌丝形态显微观察
  5.2.4 黑色素含量测定
  5.2.5 过氧化物酶和漆酶活性测定

  5.2.6 突变菌株 GgLac 基因 RT-PCR 分析
  5.2.7 线粒体呼吸链复合酶 III 活性测定
  5.2.8 菌株致病性及天名精内酯酮的活体抑菌活性测定
  5.2.9 线粒体氧消耗速率测定

  5.3 讨论
  5.3.1 GgLac 可能是供试菌株致病相关基因
  5.3.2 GgCytc1、GgCytb 和 GgIsp 对菌丝生长、黑色素含量、致病性有重要影响
  5.3.3 天名精内酯酮对呼吸链复合酶 III 铁硫蛋白亚基有重要影响
  5.4 小结

  第六章 Cytc1、Cytb 和 ISP 亚基的同源建模与分子对接
  6.1 材料方法

  6.1.1 供试材料
  6.1.2 试验方法

  6.2 结果与分析
  6.2.1 模板蛋白序列的搜索
  6.2.2 目的蛋白序列与模板蛋白序列的比对
  6.2.3 三维模型的构建
  6.2.4 模型评估

  6.2.5 Cytc1、Cytb 和 ISP 三维结构活性腔的确定
  6.2.6 天名精内酯酮与 Cytc1、Cytb 和 ISP 亚基三维结构模型的分子对接
  6.3 讨论
  6.4 小结

第七章讨论与结论

  
  7.1讨论
  
  7.1.1呼吸链复合酶III是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一

  
  课题组前期通过荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫胶体金法亚细胞定位等研究发现,天名精内酯酮在供试菌株中作用的细胞器为线粒体(Wangetal.2018)。本研究测定天名精内酯酮与线粒体呼吸链旁路呼吸抑制剂SHAM有显着增效作用,表明天名精内酯酮对供试菌株呼吸链有显着抑制作用。在此基础上,测定天名精内酯酮处理浓度和时间与供试菌株呼吸链复合酶III、I+III、II+III活性近似成负相关,而呼吸链其他酶变化并不显着。进一步通过RT-PCR测定供试菌株呼吸链复合酶III基因对天名精内酯酮较为敏感。上述结果表明供试菌株呼吸链复合酶III是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一。
  
  线粒体呼吸链复合酶III是产生ROS的主要场所(Mulleretal.2004),试验测定天名精内酯酮处理供试菌株后,线粒体ROS显着升高,引起线粒体内一系列氧化胁迫,直接导致线粒体发生病变,最终引起菌株细胞凋亡,这也再次证实了呼吸链复合酶III是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一(王兰英2018)。
  
  目前为止,呼吸链复合酶III的抑制剂较多,尤其是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是杀菌剂的一个里程碑。就作用位点来说呼吸链复合酶III的抑制剂主要分为两种类型即细胞色素b亚基上醌的氧化位点(Qo)和醌的还原位点(Qi)抑制剂,甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为Qo位点抑制剂,抗霉素A为Qi位点抑制剂(Kotiahoetal.2008)。天名精内酯酮的化学结构与已报道的呼吸链复合酶III的抑制剂结构并不属于同一类化合物,因此,天名精内酯酮对呼吸链复合酶III的作用位点可能不同于已知的抑制剂。
  
  7.1.2天名精内酯酮与抗霉素A可能作用
  
  于复合酶III的不同亚基本研究明确天名精内酯酮与水杨肟酸的增效作用,发现天名精内酯酮对线粒体呼吸链有显着抑制作用。测定线粒体呼吸链复合酶活性和相关基因实时定量PCR,表明线粒体呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感。因此,推测天名精内酯酮主要抑制小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III的活性,使呼吸链电子传递受阻而产生抑菌作用。在酶活和实时定量PCR试验基础上,本研究进一步对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III功能亚基基因细胞色素c1(GgCytc1),细胞色素b(GgCytb)和铁硫蛋白(GgISP)进行沉默和过表达载体的构建并获得沉默和过表达突变菌株。通过对小麦全蚀病菌野生型菌株和突变菌株进行生理生化指标测定,发现沉默突变菌株?GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显着降低,而OEIsp对天名精内酯酮极为敏感。天名精内酯酮EC80处理后,?GgIsp的呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率无显着变化。表明小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基对天明精内酯酮较为敏感。因此,推测天名精内酯酮极有可能与靶标菌呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基活性中心发生反应,铁硫蛋白亚基失活,进一步使靶标菌的电子传递链受阻而达到抑菌作用。
  
  关于抗霉素A的作用机理目前较为清楚,其主要是抑制生物体呼吸链复合酶III的细胞色素b亚基(Qi抑制剂),进而抑制线粒体呼吸链而影响氧化磷酸化及ATP的形成。
  
  本研究通过用抗霉素A为阳性对照,发现小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III对抗霉素A和天明精内酯酮较为敏感有类似的抑制作用。用抗霉素A和天名精内酯酮处理沉默突变菌株?GgCytc1、?GgCytb和?GgIsp后,突变菌株呼吸速率有一定的差异。抗霉素A对沉默突变菌株?GgCytb的线粒体氧消耗速率无显着抑制作用,而天名精内酯酮对沉默菌株?GgIsp的线粒体氧消耗速率无显着抑制作用,表明抗霉素A和天名精内酯酮对线粒体呼吸链复合酶III均有一定程度的抑制作用,但是作用于呼吸链复合酶III的不同亚基。
  
  7.1.3铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮潜在靶标之一
  
  在牛心呼吸链复合酶III三维晶体结构中,无抑制剂存在时,铁硫蛋白亚基靠近细胞色素c1,而当抑制剂如标桩菌素或者粘噻唑存在的情况下,铁硫蛋白亚基靠近细胞色素b亚基血红素b566的位置。标桩菌素是复合酶IIIQo位点抑制剂,其主要通过两个氢键分别与细胞色素b和铁硫蛋白亚基结合,一个是其4位的羰基氧与铁硫蛋白亚基中的His181以氢键结合,另一个是其8位的羟基与细胞色素b亚基中Glu272以氢键结合。
  
  粘噻唑以及其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂亦是呼吸链复合酶IIIQo位点抑制剂,其也是主要通过两个氢键分别与复合酶III细胞色素b和铁硫蛋白亚基结合(闫晓静等2006)。
  
  由上述可知,复合酶III铁硫蛋白亚基是一个较活跃,重要的杀菌剂靶点。铁硫蛋白亚基在生物体中有一个显着的特性即通过移动穿梭机制进行电子传递(Xiaetal.1997),这也可以解释在分子对接结果中,天名精内酯酮对铁硫蛋白亚基的结合性并不是很好,而与细胞色素b亚基的结合较好本研究采用RNAi和过表达技术对供试菌株呼吸链复合酶III功能亚基基因GgCytc1、GGCytb和GgIsp进行沉默和过表达并对获得的突变菌株进行生理生化指标比较。通过试验发现沉默突变菌株?GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显着降低,其呼吸链复合酶III的活性显着下降,而过表达突变菌株OEIsp对天名精内酯酮极为敏感。天名精内酯酮EC80处理后,?GgIsp呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率无显着变化。
  
  结果表明,复合酶III铁硫蛋白亚基对天名精内酯酮较为敏感,是其潜在的靶标之一。
  
  天名精内酯酮极有可能作用于供试菌株呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基。
  
  7.1.4天名精内酯酮抑菌机制推测
  

  经课题组前期的研究发现,天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的生物氧化有显着抑制作用,接着通过亚细胞定位发现天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体,进而对线粒体呼吸链复合酶活性测定,虽然天名精内酯酮对呼吸链复合酶I、II、III和IV均有一定的抑制作用,但是对供试菌株呼吸链复合酶III活性的抑制作用较为显着(许丹2011;Wangetal.
  
  2017;2018)。与此同时,天名精内酯酮处理供试菌株后,线粒体内的ROS含量显着的升高(杨春白云2016),有研究者认为呼吸链复合酶III是线粒体中ROS的主要产生场所(Boverisetal.1976),再次证实了呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感,是其潜在靶蛋白之一。因此,本研究在明确了呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感的基础上,对呼吸链复合酶III的基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp进行沉默和过表达并获突变菌株。通过对菌株生理生化指标测定表明铁硫蛋白亚基沉默突变体对天名精内酯酮并不敏感,高浓度的天名精内酯酮(EC80)处理菌株后,铁硫蛋白亚基沉默突变体的线粒体氧消耗速率并没有发生显着抑制。因此,推测供试菌株呼吸链复合酶III的铁硫蛋白亚基对天名精内酯酮较为敏感,极有可能是天名精内酯酮潜在作用位点之一。
  
  铁硫簇是铁硫蛋白的活性中心,最常见的是[2Fe2S]和[4Fe4S],含有铁硫簇的蛋白称为铁硫蛋白(图5-10)。目前,已经发现超过120种铁硫蛋白,其参与线粒体的电子传递、催化作用以及对基因表达的调控等作用,但是最主要功能为参与线粒体电子传递(XuandM?ller2011)。研究发现在真核生物中,铁硫簇在细胞中有两条合成途径,分别在线粒体和细胞质中进行合成铁硫簇,其中,铁硫簇合成的最主要的途径是在线粒体中进行,并且其生物合成过程具有高度的保守性(Amelaetal.2013)。在人细胞中发现数十种铁硫蛋白,分布在线粒体内的有呼吸链复合酶I(8个铁硫中心)、复合酶II(3个铁硫中心)、复合酶III(1个铁硫中心)、铁氧化还原蛋白、硫辛酸、生物素合成酶以及顺乌头酸酶,但其中参与呼吸链电子传递的只有呼吸链复合酶I、II和III中的铁硫蛋白。
  
  因此,如图7-1所示,天名精内酯酮极可能与靶标菌呼吸链复合酶I、II和III中的铁硫蛋白活性中心发生反应,导致铁硫蛋白活性中心坍塌而失去传递电子的功能,进而使线粒体内ROS积累,过氧化物酶活性升高、引起靶标菌一系列氧化胁迫,最终线粒体释放凋亡因子引起靶标菌死亡而达到抑菌作用。线粒体呼吸链电子传递有两条途径,电子从复合酶I→复合酶III→复合酶IV或者从复合酶II→复合酶III→复合酶IV最后传递给氧。这与第二章的结果一致,天名精内酯酮处理靶标菌后,发现呼吸链复合酶I、II和III活性都有不同程度的抑制,然而,复合酶III活性降低最为显着。再者,靶标菌体内铁硫簇很多,为什么天名精内酯酮只与呼吸链复合酶中的铁硫簇活性中心发生反应呢?笔者通过查阅文献发现,其一,虽然靶标菌细胞质和线粒体中均含有铁硫簇,但是线粒体是铁硫簇的主要活动场所。虽然细胞质和线粒体中都可以合成铁硫蛋白,但是细胞质中合成铁硫蛋白的某些物质,还是在线粒体中合成并转运到细胞质中,如在线粒体中合成铁硫蛋白过程会产生一种含硫复合物(X-S),现已证实,X-S被运输载体转运到细胞质中,并调控胞质中铁硫蛋白的合成(Molina-Navarroetal.2006;Uzarskaetal.2013;郑华珍等2015)。其二,铁硫蛋白最主要的功能是在呼吸链中起着电子传递作用,其铁离子通过在Fe2+和Fe3+间互相转换进行电子的传递(VenkateswaraandHolm2004),并且其在生物体中进行电子传递时不断的进行移动穿梭。笔者推测铁硫蛋白在进行电子传递时,在Fe2+和Fe3+之间转换过程中可能有某一个不稳定态,或者在其移动穿梭过程中的某一个构像与天名精内酯酮发生反应。这就可以解释靶标菌的细胞质和线粒体中均有铁硫蛋白的分布,而天名精内酯酮只作用于线粒体中。
  
  7.2主要结论
  
  本文通过天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链的作用机制研究,主要进行以下试验:天名精内酯酮与SHAM对靶标菌线粒体呼吸链的增效作用、靶标菌线粒体呼吸链复合酶活性测定以及相关复合酶基因实时荧光定量PCR,比较了天名精内酯酮和抗霉素A对供试菌株呼吸链复合酶III的影响。随后,利用RNAi、过表达技术以及同源模建与分子对接等进一步明确天名精内酯酮对靶标菌呼吸链复合酶III功能亚基的影响,主要得到以下结论:
  
  (1)天名精内酯酮与SHAM有显着增效作用,表明天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链有显着抑制作用。
  
  (2)天名精内酯酮处理浓度和时间与靶标菌呼吸链复合酶III、I+III、II+III活性成负相关,且复合酶III基因GgCyc对天名精内酯酮较为敏感,表明小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感,是其潜在靶蛋白之一。
  
  (3)抗霉素A与天名精内酯酮的作用机理不一致,可能作用于靶标菌呼吸链复合酶III的不同亚基。
  
  (4)基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp对菌株的生长极其重要,当基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp沉默后,菌株的菌丝变细、端部分枝减少、菌丝的生长速率缓慢、对过氧化氢产生的氧化压敏感性显着的降低、漆酶活性降低、致病力较弱。沉默菌株?GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显着降低,EC50为156.18μg/mL,过表达菌株OEIsp对天名精内酯酮极敏感EC50为25.88μg/mL.
  
  (5)沉默突变菌株?GgIsp呼吸链复合酶III活性较低,天名精内酯酮EC80处理后,其呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率无显着变化,即?GgISP对天名精内酯酮并不敏感,推测复合酶III铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮的潜在靶标之一。
  
  (6)本研究推测天名精内酯酮的抑菌机理为:天名精内酯酮主要进入供试菌株线粒体中,并与呼吸链复合酶III中铁硫蛋白亚基发生反应,显着抑制复合酶III活性,使呼吸链电子传递受阻,线粒体ROS堆积,引起病菌一系列氧化胁迫,最终线粒体释放凋亡因子,引起细胞凋亡而达到抑菌作用。
  
  7.3本研究创新点
  
  (1)本研究明确天名精内酯酮对呼吸链有显着抑制作用。
  
  (2)本研究初步明确呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮靶标之一。
  
  (3)本研究对小麦全蚀病菌进行遗传转化体系的构建和优化,并利用RNAi和过表达技术首次对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp进行沉默和过表达,为小麦全蚀病菌突变菌库的构建奠定基础。
  
  7.4有待进一步解决的问题
  

  (1)与潜在靶蛋白亚基相关性分析(微量热泳动分析)本论文以小麦全蚀病菌为供试菌株,初步研究了天名精内酯酮对供试菌株呼吸链的抑菌机制。还需要大量的试验来明确天名精内酯酮与潜在靶标的相互作用。下一步可以利用微量热泳动技术检测由于结合而引起的生物分子的大小、电荷和水化层的变化以及蛋白-蛋白之间的相互作用。
  
  (2)与潜在靶蛋白亚基晶体制备与分析本研究中并未对呼吸链复合酶III以及其与天名精内酯酮结合的晶体结构进行分离。
  
  在今后研究中,可以尝试对天名精内酯酮与靶蛋白结合的晶体结构进行分离纯化,得到药剂与蛋白晶体结构,进一步验证天名精内酯酮对供试菌株的抑菌机制。

  参考文献
 

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